細(xì)胞自噬對(duì)饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用*

江立波， 張小磊， 徐華梓， 吳瑞凱， 楊光永， 吳 畏， 胡旭琪， 鄭旭浩

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院脊柱外科, 浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)07-1302-06

2012-01-16

2012-03-28

浙江省“重中之重”學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目(No. 2011GK001)

△通訊作者 Tel：0577-88002854；E-mail：spinexu@163.com

細(xì)胞自噬對(duì)饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用*

江立波， 張小磊， 徐華梓△， 吳瑞凱， 楊光永， 吳 畏， 胡旭琪， 鄭旭浩

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院脊柱外科, 浙江 溫州 325000)

目的探討?zhàn)囸I條件下椎間盤髓核細(xì)胞是否發(fā)生自噬及自噬對(duì)髓核細(xì)胞的作用。方法原代培養(yǎng)SD大鼠髓核細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定后，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)加DMEM培養(yǎng)基組、3-MA加EBSS培養(yǎng)基組和EBSS饑餓組，接著用單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色、透射電鏡和Western blotting觀察各組細(xì)胞的自噬差異，最后采用CCK-8法測定細(xì)胞生長抑制率以及TUNEL法測定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果成功培養(yǎng)出SD大鼠髓核細(xì)胞。與對(duì)照組相比，電鏡和熒光顯微鏡下觀察到EBSS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞出現(xiàn)自噬囊泡，但是3-MA 抑制后細(xì)胞自噬泡明顯減少；Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)LC3-II/LC3-I和Beclin-1/β-actin在EBSS處理組明顯大于3-MA+EBSS處理組和對(duì)照組(P<0.05), 而3-MA+EBSS處理組的細(xì)胞抑制率和凋亡率明顯高于EBSS處理組(P<0.05)。結(jié)論饑餓可以誘導(dǎo)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞發(fā)生自噬，并且3-MA能抑制自噬發(fā)生。自噬對(duì)饑餓環(huán)境下的髓核細(xì)胞可能具有一定的保護(hù)作用。

髓核細(xì)胞; 自噬; 細(xì)胞凋亡; 饑餓

椎間盤退變往往伴隨著椎間盤細(xì)胞數(shù)目的減少和活性的降低，同時(shí)髓核細(xì)胞的減少影響了細(xì)胞外蛋白多糖和II型膠原的代謝平衡，這已經(jīng)被許多文獻(xiàn)所認(rèn)可[1-2]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞有3種死亡方式，分別為壞死、凋亡和新發(fā)現(xiàn)的自噬，而凋亡已被認(rèn)為與椎間盤的退變有密切的聯(lián)系[1]，可是細(xì)胞自噬在椎間盤領(lǐng)域的研究目前仍然較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SD大鼠的纖維環(huán)細(xì)胞經(jīng)無血清饑餓誘導(dǎo)后有自噬現(xiàn)象[2]，而椎間盤髓核細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及其作用尚未有明確的研究，因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)的方法來觀察髓核細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及其對(duì)細(xì)胞的作用。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco)，Eagle’s balanced salt solution(EBSS)及II型膠原酶(Gibco),3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;Sigma),TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche)，單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)熒光染料(Gibco)，Cell Counting Kit-8(CCK-8;Dojind)、RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及ECL發(fā)光液(上海碧云天公司)，LC3、Beclin-1及β-actin兔抗大鼠多克隆抗體(CST),羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(北京康為世紀(jì)公司)，SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)為SCXK(浙)2010-0044。

2細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

取約150 g重的SD大鼠，無菌環(huán)境下取出整個(gè)腰椎，移至細(xì)胞房用10倍顯微鏡將膠凍狀的髓核細(xì)胞取出，見圖1，置于含有1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，將5只SD大鼠的髓核聚集起來，洗凈后，將髓核組織轉(zhuǎn)移到離心管中，用0.1%II型膠原酶和2 kU/L透明質(zhì)酸酶消化4 h，離心后用吸管將組織種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，2 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含1×105U/L青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺，100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。當(dāng)原代細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰酶傳代以3×105細(xì)胞接種于6孔板中爬片，待細(xì)胞貼壁以后進(jìn)行II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色、甲苯胺藍(lán)染色及阿利新藍(lán)染色。

Figure 1. The process of separating gel-like nucleus pulposus from the anulus fibrosus under dissecting microscope.A:the intact intervertebral disc;B:the gel-like nucleus pulposus was isolated from the intervertebral disc when the endplate was cut off by the scissors.

圖1顯微鏡下分離膠凍樣髓核組織的過程

3細(xì)胞的分組及處理

所用細(xì)胞均為第2代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，分組為： (1) 對(duì)照組(A組)：用上述的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細(xì)胞； (2)3-MA+DMEM組(B組)：含有10 mmol/L 3-MA的上述DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2 h; (3)3-MA+EBSS(C組)：首先用含有10 mmol/L 3-MA的上述DMEM培養(yǎng)液處理預(yù)處理細(xì)胞1 h，之后換用含有10 mmol/L 3-MA的EBSS平衡鹽饑餓髓核細(xì)胞2 h； (4) EBSS(D組)：用EBSS平衡鹽溶液饑餓細(xì)胞2 h。

4細(xì)胞自噬的鑒定

4.1MDC熒光染色鑒定髓核細(xì)胞的自噬泡 采用Biederbick等[3]實(shí)驗(yàn)方法，將各組細(xì)胞爬片進(jìn)行處理后，去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，用0.05 mmol/L MDC染料于37 ℃孵育細(xì)胞60 min，吸去染料后用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗2次，晾干后立刻用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)濾片為365 nm，阻斷濾片為430 nm。在200倍視野下，隨即取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)含有點(diǎn)狀自噬泡的細(xì)胞，并計(jì)算自噬細(xì)胞比率=含自噬泡的細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞，重復(fù)3次 ,計(jì)算平均值。

4.2透射電鏡觀察髓核細(xì)胞的自噬現(xiàn)象 各組取2瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行處理并離心成團(tuán)，在EP管中2%戊二醛4 ℃固定過夜，PBS漂洗，1%鋨酸固定，醋酸鈾染色，梯度丙酮脫水，預(yù)包埋，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行定位，LKB-V超薄切片機(jī)超薄切片，透射電鏡下觀察髓核細(xì)胞。

4.3Western blotting檢測髓核細(xì)胞的LC3和Beclin-1蛋白的表達(dá) 在6孔板中將各組細(xì)胞用PBS洗2遍后，用蛋白提取緩沖液RIPA(radioimmunoprepciption assay)和蛋白酶抑制劑PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)提取細(xì)胞的蛋白，BCA法測定總濃度大小，SDS-PAGE電泳，將LC3目的蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm大小的PVGF膜上，而Beclin-1和內(nèi)參照則轉(zhuǎn)至0.45μm的膜上，封閉，孵LC3抗體(1∶500)、Beclin-1抗體(1∶500)及β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2 500)，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

5細(xì)胞生長活性及凋亡水平的檢測

5.1CCK-8法測定各組細(xì)胞的抑制率 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將濃度為5×1010/L的細(xì)胞接種到96孔板中，每孔為100 μL,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞的DMEM和EBSS分別作為本底值，A組為空白對(duì)照組，各組在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后使其貼壁，用PBS清洗后，分別換用100 μL的不同培養(yǎng)液后,孵育1 h，加入CCK-8反應(yīng)液10 μL, 于37 ℃下再孵育1 h，總共處理時(shí)間為2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：B組細(xì)胞生長抑制率= (空白對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(空白對(duì)照組A值-DMEMA值)，C、D組細(xì)胞生長抑制率= [(空白對(duì)照組A值-DMEMA值)-(實(shí)驗(yàn)組A值-EBSSA值) ]/(空白對(duì)照組A值-DMEMA值)。

5.2TUNEL熒光比較不同組的凋亡水平 將細(xì)胞爬片按照分組進(jìn)行不同的處理后，吸取處理液后用10%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,再加入0.1%Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min,按TUNEL凋亡試劑盒說明進(jìn)行操作后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。在200倍視野下數(shù)細(xì)胞總數(shù)，熒光下數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目，重復(fù)取3個(gè)視野，取平均值，計(jì)算髓核細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

椎間盤髓核細(xì)胞大多為多角形或者梭形，有較長的突起，可以跨越幾個(gè)細(xì)胞的長度，顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中有分布較大的囊泡，原代培養(yǎng)15 d左右達(dá)到融合狀態(tài)，傳代次數(shù)增多后細(xì)胞逐漸呈長梭形。原代中同時(shí)看到圓形的、大于髓核細(xì)胞的脊索細(xì)胞，內(nèi)含大量空泡狀結(jié)構(gòu)，并且?guī)缀醪辉鲋?，周圍往往被梭形?xì)胞包繞。II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞胞質(zhì)中棕黃色的顆粒，以核周為著；甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞胞質(zhì)異染成紫色；阿利新藍(lán)染色可見細(xì)胞質(zhì)染成淡藍(lán)色，見圖2。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為髓核的類軟骨樣細(xì)胞。

Figure 2. The morphological presentation of nucleus pulposus cells (×200). A： under phase-contrast microscope; B: toluidine blue staining;C: Alcian blue staining;D: immunocytochemical staining for type II collagen.

圖2髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2MDC熒光染色觀察各組髓核細(xì)胞的自噬泡

熒光顯微鏡下可見D組細(xì)胞吸收MDC染料，從而較多細(xì)胞均含有大量點(diǎn)狀藍(lán)綠色熒光結(jié)構(gòu)，主要分布在核周圍，而C組含藍(lán)綠色點(diǎn)狀物質(zhì)的細(xì)胞較D組明顯減少(且細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)密度也明顯降低)，A組和B組的細(xì)胞內(nèi)均無明顯的自噬泡出現(xiàn)，見圖3。計(jì)算A、B、C和D組的自噬細(xì)胞百分率分別為(4.9±1.2)%、(4.7±1.0)%、(11.1±1.7)%和(67.7±8.8)%， D組與A、B、C組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A、B、C各組之間無明顯差異(P>0.05)。

Figure 3. MDC staining of the autophagic vacuoles in nucleus pulposus cells(×400).A:control;B:3-MA+DMEM;C:3-MA+EBSS;D:EBSS.

圖3髓核細(xì)胞MDC熒光染色

3電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

A組髓核細(xì)胞大小約為10 μm，細(xì)胞核呈圓形，核膜完整，無明顯切跡，胞漿內(nèi)清晰可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和散在的致密糖原顆粒；B組細(xì)胞超微形態(tài)與A組細(xì)胞相似；C組可見細(xì)胞明顯固縮，較正常髓核細(xì)胞小，細(xì)胞核亦逐漸固縮，染色質(zhì)濃集，電子密度增高，并且形成凋亡小體，偶爾亦可見自噬泡，同時(shí)可以看到部分細(xì)胞壞死，細(xì)胞漿崩解，沒有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。D組可見細(xì)胞核仍然呈圓形，并無明顯固縮，但是細(xì)胞漿內(nèi)可見大量囊泡狀結(jié)構(gòu)，在高倍鏡下可見雙層膜結(jié)構(gòu)，將各種蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器包裹，見圖4。

Figure 4. Electron micrographs of nucleus pulposus cells.A:a normal cell; B: the autophagosomes with double-limiting membrane in nucleus pulposus cells of EBSS treatment group; C：apoptotic changes including cell condensation and apoptoic body in 3-MA+EBSS group; D: necrotic cells in 3-MA+EBSS group.

圖4髓核細(xì)胞的電鏡下表現(xiàn)

4各組細(xì)胞的LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平

Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)D組細(xì)胞的LC3-II/LC3- I和 Beclin-1/β-actin的灰度值明顯大于A、B和C組(P<0.05)，并且C組的LC3-II/LC3- I灰度值比A組和B組大(P<0.05)， Beclin-1/β-actin值在A、B、C組中均無明顯差異(P>0.05),見圖5。

5各組細(xì)胞的生長抑制率

A、B、C和D組的細(xì)胞生長抑制率分別為0、(1.71±1.05)%、(62.69±6.39)%和(33.39±4.59)%，A組和B組的抑制率無明顯差異(P>0.05)， C組細(xì)胞生長抑制率明顯大于其余各組(P<0.05)，同時(shí)D組亦大于A組和B組(P<0.05)，見圖6。

6各組細(xì)胞的凋亡水平比較

TUNEL熒光染色可見C組有較多陽性細(xì)胞，D組相對(duì)較少，而A組和B組幾乎沒有陽性細(xì)胞。C組的髓核細(xì)胞凋亡率為33.41%，明顯高于D組的15.53%(P<0.05)，而A組和B組幾乎沒有細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖7。

討 論

細(xì)胞自噬通過自噬泡與溶酶體結(jié)合來降解細(xì)胞內(nèi)老化和損壞的細(xì)胞器以及錯(cuò)構(gòu)和多余的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生新的氨基酸和能量，進(jìn)而參與細(xì)胞的各種病理生理過程，這是一種相對(duì)保守的機(jī)制[4]。細(xì)胞自噬往往與老年性疾病有密切聯(lián)系，Carames等[5]證實(shí)人類骨關(guān)節(jié)炎和小鼠的關(guān)節(jié)炎模型與自噬密切相關(guān)，并且自噬可能對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用，Ye等[6]人亦證實(shí)在大鼠退變的椎間盤中存在自噬現(xiàn)象。椎間盤退變亦作為一種年齡相關(guān)性疾病，目前尚不清楚細(xì)胞自噬在椎間盤退變中的具體機(jī)制。

圖5各組細(xì)胞的LC3和Beclin-1蛋白的表達(dá)

圖6CCK-8法測定各組細(xì)胞的生長抑制率

細(xì)胞周圍環(huán)境的改變可以引起細(xì)胞的各種應(yīng)激反應(yīng)，而細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)上調(diào)自噬水平。將細(xì)胞進(jìn)行各種物質(zhì)的饑餓，如氨基酸、生長因子、氧氣、能量等，均可以引起細(xì)胞自噬，但是最能提高細(xì)胞自噬水平的是氨基酸[7]，如本實(shí)驗(yàn)所用的EBSS培養(yǎng)基就是無氨基酸的培養(yǎng)基。因?yàn)榧?xì)胞自噬通過降解胞漿中的老化蛋白質(zhì)和細(xì)胞器而為細(xì)胞和細(xì)胞周圍環(huán)境補(bǔ)充新的氨基酸，如果降低周圍環(huán)境中的氨基酸的總量，細(xì)胞則通過提高自噬水平來負(fù)反饋增加細(xì)胞周圍環(huán)境中氨基酸的含量，而這些氨基酸主要用來合成那些適應(yīng)饑餓的蛋白質(zhì)，如溶酶體酶、氧化呼吸鏈上的蛋白以及抗氧化酶等等[8]。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡、MDC觀察到了髓核細(xì)胞雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡的形成，并且運(yùn)用Western blotting檢測到自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3- I和 Beclin-1/β-actin較對(duì)照組有顯著升高，因此作者從多方面證實(shí)了無氨基酸的EBSS培養(yǎng)基可以顯著提高大鼠椎間盤髓核細(xì)胞的自噬水平，這與其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞相似[2]。

圖7各組細(xì)胞的TUNEL熒光染色及凋亡率

Shen等[2]證實(shí)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞在無血清饑餓環(huán)境下存在24 h后出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，但是細(xì)胞自噬是對(duì)周圍環(huán)境改變的快速反應(yīng)過程，往往只需要幾小時(shí)，并且細(xì)胞自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，自噬流(autophagy flux)會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生改變[9]。本實(shí)驗(yàn)用EBSS培養(yǎng)基只將髓核細(xì)胞饑餓2h，能夠較為準(zhǔn)確地在自噬流高峰期進(jìn)行檢測。椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)主要依靠終板的滲透和外層纖維環(huán)的血供，因此椎間盤退變時(shí)終板的鈣化主要導(dǎo)致髓核細(xì)胞的營養(yǎng)缺乏，使得髓核細(xì)胞處于一種相對(duì)饑餓的狀態(tài)；并且伴隨椎間盤退變的主要是髓核細(xì)胞的減少和活性降低，因此本文以饑餓髓核細(xì)胞2 h為研究手段可以更好地探討體內(nèi)椎間盤營養(yǎng)缺乏時(shí)對(duì)于髓核細(xì)胞自噬的影響，從而為揭露細(xì)胞自噬在椎間盤退變中的作用提供一定的基礎(chǔ)。

電鏡是證明自噬和凋亡現(xiàn)象的金標(biāo)準(zhǔn)，我們通過電鏡在饑餓的髓核細(xì)胞中同時(shí)觀察到了自噬和凋亡現(xiàn)象。自噬和凋亡起源于同一上游信號(hào)通路，在各種環(huán)境下通過Bcl-2、Bax和Beclin-1的相互結(jié)合和磷酸化，調(diào)節(jié)凋亡和自噬的各自主導(dǎo)優(yōu)勢，如在饑餓的環(huán)境下，Bcl-2發(fā)生磷酸化并與Beclin-1分離，在Beclin-1作用下細(xì)胞逐漸形成大量的自噬泡，對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行保護(hù)，并且通過磷酸化的Bcl-2與Bax結(jié)合來降低細(xì)胞的凋亡水平[10-11]。我們將大鼠的髓核細(xì)胞在無氨基酸的EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，成功地誘導(dǎo)出自噬現(xiàn)象，另外用自噬特異性抑制劑3-MA處理饑餓細(xì)胞后成功地部分抑制了細(xì)胞的自噬，但是細(xì)胞的凋亡和抑制率反而增加了，而設(shè)立的3-MA+DMEM組并沒有發(fā)現(xiàn)3-MA能誘導(dǎo)正常環(huán)境下的髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡或?qū)λ韬思?xì)胞抑制作用，因此間接地證明了一定限度的細(xì)胞自噬可以抑制饑餓環(huán)境中髓核細(xì)胞的死亡，進(jìn)而對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。體內(nèi)退變的髓核細(xì)胞亦處于營養(yǎng)缺乏的環(huán)境，并且也有研究證明了退變的髓核細(xì)胞中存在自噬現(xiàn)象[6]，但是體內(nèi)椎間盤的自噬現(xiàn)象是否與椎間盤的營養(yǎng)缺乏有關(guān)，細(xì)胞自噬對(duì)退變的椎間盤到底有什么樣的作用？這些均需要進(jìn)一步探索。

細(xì)胞凋亡已經(jīng)被認(rèn)為是參與椎間盤退變的重要因素之一，Ha等[12]通過體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在退變的椎間盤髓核和終板中細(xì)胞凋亡率明顯高于正常椎間盤，并且Sudo等[13]通過siRNA的方法抑制細(xì)胞凋亡可以緩解椎間盤退變。本研究間接地發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞的自噬亦可以抑制饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，雖然體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)的細(xì)胞具有較大差異性，但是本文為未來椎間盤的治療和具體機(jī)制的闡述可以提供一定的基礎(chǔ)。

在饑餓環(huán)境下，自噬通過降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為細(xì)胞提供能量、氨基酸，從而保護(hù)細(xì)胞應(yīng)付周圍環(huán)境。但是在一定條件下，過度的細(xì)胞自噬亦會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡——自噬死亡[14]，如Xue等[15]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)生長因子撤退的情況下，自噬可能介導(dǎo)了神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。本文所使用的EBSS培養(yǎng)基是常規(guī)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的環(huán)境，將髓核細(xì)胞饑餓2h并未引起細(xì)胞大量的自噬死亡，因此這個(gè)誘導(dǎo)自噬的模型能夠較為可靠地研究髓核細(xì)胞的自噬。但是細(xì)胞自噬是一把雙刃劍，隨著饑餓時(shí)間的延長，細(xì)胞自噬對(duì)髓核細(xì)胞的影響尚需要進(jìn)一步的研究。

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Protectiveeffectofautophagyonnucleuspulposuscellsunderstarvation

JIANG Li-bo, ZHANG Xiao-lei, XU Hua-zi, WU Rui-kai, YANG Guang-yong, WU Wei, HU Xu-qi, ZHENG Xu-hao

(DepartmentofSpineSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:spinexu@163.com)

AIM: To explore the possibility that the starvation environment induces autophagy of nucleus pulposus cells.METHODSPrimary rat nucleus pulposus cells was cultured and stained with toluidine blue, Alcian blue and immunocytochemistry for typeⅡ collagen. The cultured cells were divided into 4 groups: control group, 3-methyladenine (3-MA)+DMEM group, 3-MA+EBSS group and EBSS group. The cells were detected for autophay using monodansylcadaverine (MDC) staining, electron microscopy and Western blotting. At the same time, the inhibitory rate and apoptotic rate of the cells were detected by Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay and TUNEL staining, respectively.RESULTSCompared with control group, the autophagosomes were observed in nucleus pulposus cells under electron microscope and fluorescence microscope in EBSS group, and the 3-MA+EBSS treatment suppressed the formation of autophagosomes. The results of Western blotting analysis showed that the ratios of LC3-II/LC3- I and Beclin-1/β-actin in EBSS treatment group were higher than those in control group and 3-MA+EBSS treatment group. However, the apoptotic rate of nucleus pulposus cells and the inhibitory rate of cell viability were increased in 3-MA+EBSS treatment group.CONCLUSIONAutophagy of nucleus pulposus cells is induced by nutrient starvation, and 3-MA suppresses the response. Autophagy may have a protective effect on nucleus pulposus cells under the condition of starvation.

Nucleus pulposus cells; Autophagy; Apoptosis; Hunger

R329.25

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.028