糖基化反應對提高魚糜蛋白質(zhì)凝膠性的影響

周錦晶，吳 紅，徐 歡，肖功年

（1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023；3.杭州唯新食品有限公司，杭州310052）

魚糜制品是新鮮魚肉經(jīng)擂潰、斬拌、成形等過程而制成的凝膠食品，是海洋食品加工中的一種重要功能性原料，是全球生產(chǎn)、消費量最大的水產(chǎn)食品之一［1］。衡量魚糜制品品質(zhì)的主要指標有凝膠強度、口味、質(zhì)地和形態(tài)等，而凝膠性能是衡量魚糜制品品質(zhì)的重要指標，它直接影響到魚糜制品的商業(yè)價值。

國內(nèi)外大量的實驗研究表明，蛋白質(zhì)用還原糖進行糖基化修飾能提高食品蛋白質(zhì)的功能特性，尤其是凝膠特性。糖基化修飾的主要方法有水溶性碳化二亞胺法和美拉德反應法［2］。其中美拉德反應是一種在食品工業(yè)中常見的蛋白質(zhì)糖基化反應，它是還原糖與蛋白質(zhì)分子上游離賴氨酸的α-NH2或ε-NH2共價連接而形成糖蛋白的過程。該方法是一個自然、自發(fā)的反應，不需要外加化學試劑，加熱就可以很大程度地加速該反應的進程［3］。早在1948年Ferry就指出，蛋白質(zhì)形成凝膠的機理是蛋白質(zhì)受熱而變性展開，受熱變性展開的蛋白質(zhì)基團因聚合作用而形成較大分子的凝膠體。糖基化接枝反應可增加蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量及有利于形成蛋白質(zhì)空間網(wǎng)絡(luò)，從而增強了蛋白質(zhì)空間位阻作用，減少了蛋白質(zhì)在預凝膠狀態(tài)下形成聚集物所需要的單體數(shù)目；蛋白質(zhì)在單體數(shù)目一定的條件下，形成了更多數(shù)量的膠體粒子和更致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［4］。

Handa和Kuroda研究了美拉德反應蛋白粉和葡萄糖之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)其在特定的控制條件下能提高蛋白粉的凝膠特性。許雅琴、楊嚴俊采用果膠酶水解果膠、鹽酸水解魔芋膠和瓜爾豆膠的方式得到了3種膠的水解產(chǎn)物，并將其分別與脫糖雞蛋粉進行美拉德反應。發(fā)現(xiàn)所得蛋白粉-瓜爾豆膠復合物的凝膠強度達1 351.3cN（1 378.9g），比普通蛋白粉提高了1 207%，且反應后蛋白粉的色澤、消化性、溶解性均可接受［5］。而目前將此技術(shù)應用于改善魚糜蛋白質(zhì)凝膠性的研究較少，因此，筆者嘗試開展糖基化技術(shù)提高魚糜蛋白質(zhì)的凝膠性研究。通過研究殼聚糖添加量、加熱溫度和加熱時間等單因素對魚糜制品凝膠強度和持水力的影響，以期為魚糜制品新產(chǎn)品的開發(fā)和產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

冷凍魚糜，杭州唯新食品有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥90.0%），生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司；食鹽，食品級，浙江省鹽業(yè)集團有限公司；可溶性淀粉（AR），國藥集團化學試劑有限公司；實驗室常規(guī)試劑等。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Texture Analyser，TA.XT Plus，英國Stable Micro System公司；電熱恒溫水浴鍋，DKS-24，杭州藍天化驗儀器廠；九陽料理機，JYL-350，山東九陽小家電有限公司；電子天平，SCA-210，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；砧板，刀，筷子，實驗室常規(guī)玻璃儀器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 質(zhì)量分數(shù)14%淀粉和不同殼聚糖添加量的魚糜凝膠的制備

取冷藏魚糜500g，半解凍后細切為小丁，用料理機在10℃以下空擂5min，添加質(zhì)量分數(shù)2.5%食鹽繼續(xù)鹽擂15min，然后加入不同添加量的殼聚糖（添加量分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）和14%淀粉進一步擂潰5min，再將魚糜制成直徑約為30mm的魚丸，加熱后將魚丸在冰水浴中冷卻，待測。

1.2.2 不同加熱溫度下魚糜凝膠的制備

取冷藏魚糜500g，半解凍后細切為小丁，用料理機在10℃以下空擂5min，添加質(zhì)量分數(shù)2.5%食鹽繼續(xù)鹽擂15min，然后添加14%淀粉進一步擂潰5min，再將魚糜制成直徑約為30mm的魚丸，采用二段加熱法進行加熱，先是將制品分別在30、35、40、45、50、55℃條件下加熱60min，然后在90℃下加熱30min，加熱后將魚丸在冰水浴中冷卻，待測。

1.2.3 不同加熱時間下魚糜凝膠的制備

取冷藏魚糜500g，半解凍后細切為小丁，用料理機在10℃以下空擂5min，添加2.5%食鹽繼續(xù)鹽擂15min，然后添加14%淀粉進一步擂潰5min，再將魚糜制成直徑約為30mm的魚丸，采用二段加熱法進行加熱，先是將制品在40℃條件下分別加熱30、60、90、120min，然后在90℃下加熱30min，加熱完畢后將魚丸在冰水浴中冷卻，待測。

1.3 測試方法

1.3.1 凝膠強度的測定

制備好的魚丸采用質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT Plus）分析其凝膠強度［6］。采用A／CKB探頭，測試參數(shù)如下：測前速度為2mm／s的速度，測試速度為1mm／s，測試后速度為10mm／s，壓縮深度為15mm（約為凝膠總高度的50%）。通過分析穿刺至相同深度的同一批樣品中達到其對應曲線上最高峰處所需力的大小來比較其凝膠強度。

1.3.2 持水力的測定

采用重物擠壓濾紙吸收法［7］，將切成厚度為3mm薄片的魚腸片段夾在上下各3層濾紙中間，用重物（5kg）擠壓2min，稱量前后質(zhì)量的變化作為持水性的參照。持水力按下式計算：

持水力／%＝（擠壓后魚腸質(zhì)量／擠壓前魚腸質(zhì)量）×100

每組試驗重復4次，試驗結(jié)果為4次測定結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖添加量對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響

淀粉是魚糜制品加工中最重要的填充劑，能增強魚糜制品的剛性和凝膠強度，改善組織結(jié)構(gòu)，減低生產(chǎn)成本。劉鑫等［8］研究發(fā)現(xiàn)，淀粉添加量（質(zhì)量分數(shù)）在0%～20%之間時，隨著淀粉添加量的增加，魷魚魚糜凝膠的凝膠強度和持水力不斷增大，二者呈現(xiàn)正相關(guān)的對應關(guān)系；且添加質(zhì)量分數(shù)20%馬鈴薯淀粉比添加8%馬鈴薯淀粉的凝膠結(jié)構(gòu)更致密、均勻。根據(jù)《中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標準》（SC／T 3701—2003）規(guī)定，冷凍魚糜中淀粉的添加量含量要求為≤15%，且淀粉添加量大也會影響其口感。因此，選取14%淀粉作為填充劑，一則改善魚糜制品的凝膠特性和品質(zhì)，二則降低生產(chǎn)成本。

殼聚糖（Chitosan）是自然界中少見的陽離子多糖，它在食品中的應用主要有以下幾種功能：抑制食品中有害微生物生長繁殖；增強制品凝膠特性，提高制品的保水力；延緩食品中脂肪的氧化速率［9］。張茜，夏文水［10］研究發(fā)現(xiàn)：將殼聚糖添加到鰱魚糜制品中，隨著殼聚糖添加量的增加，魚糜凝膠強度、全質(zhì)構(gòu)（TRA）都有明顯的增加，持水力減少，添加1.0%殼聚糖的魚糜凝膠強度與添加質(zhì)量分數(shù)4.0%淀粉的魚糜凝膠強度相當。添加不同量（質(zhì)量分數(shù)）殼聚糖制得的產(chǎn)品凝膠強度試驗結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)量分數(shù)14%淀粉與不同殼聚糖添加量對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響Fig.1 Effect of 14%starch and chitosan addition amount on Gel strength of surimi protein

由圖1可以看出，當14%淀粉和不同添加量的殼聚糖復配添加時，魚糜制品的凝膠強度隨著殼聚糖添加量的增加而增加，當添加量為0.4%時，魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度達到最大值，此時破斷強度為25.9N，相較于對照樣（破斷強度為22.2N）提高了16.7%。這主要是因為魚糜蛋白質(zhì)分子上游離賴氨酸的α-NH2或ε-NH2與殼聚糖的還原性末端發(fā)生糖基化接枝反應，形成了糖蛋白，增加了蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，同時也引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無序性的增加，改善了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，形成了更加致密的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；又由于魚糜蛋白質(zhì)表面接枝上的殼聚糖分子含有大量的羥基基團，有利于凝膠形成后期分子間氫鍵的形成，使蛋白質(zhì)形成相當有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而提高了魚糜制品的凝膠強度［11］。但當添加量超過0.4%后，反而隨著添加量的增加，凝膠強度逐漸降低。這可能是因為殼聚糖比較難與水分子結(jié)合，反而影響了糖基化反應。

2.2 殼聚糖添加量（質(zhì)量分數(shù)）對魚糜凝膠持水力的影響

林毅等［12］研究了水溶性殼聚糖對梅魚魚丸儲藏過程中凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)添加一定濃度的殼聚糖可顯著提高魚糜制品的凝膠強度，提高硬度、彈力和咀嚼性，保水彈性、黏著性和凝聚性。本研究也探討了殼聚糖添加量對魚丸凝膠持水力的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，魚糜蛋白質(zhì)的持水力隨著殼聚糖添加量的增加先變大后減小。在殼聚糖添加量為0.4%，持水力達到最大值即98.52%，相較于對照樣（98.12%）持水力提升了0.4%。由于殼聚糖與魚糜蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應，分布于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部球蛋白的疏水基團會更多地暴露在其表面。蛋白質(zhì)分子表面疏水性增加，更有利于分子間的疏水作用和凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而固定更多的水分，提高魚糜蛋白質(zhì)的持水力。當添加量超過0.4%后，持水力開始降低，尤其是當添加量為1.0%時，持水力與空白樣結(jié)果相近，這可能是因為殼聚糖濃度上升到一定程度后，增強了電荷之間的排斥作用，減弱了蛋白質(zhì)分子間的作用力和空間位阻作用，增加了蛋白質(zhì)溶解性，反而降低了持水力。因此在14%淀粉基礎(chǔ)上，添加0.4%～0.6%的殼聚糖是較適的比例，有利于增強凝膠結(jié)合力，增加保水性。

圖2 殼聚糖添加量對魚糜蛋白質(zhì)持水力的影響Fig.2 Effect of chitosan addition content on water-holding capacity of surimi protein

2.3 加熱溫度對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響

溫度對魚糜制品的彈性影響較大，在魚糜制品加工過程中，通過調(diào)節(jié)溫度來提高魚糜制品的凝膠強度是一個重要的技術(shù)手段。楊賢慶等［13］通過對凝膠化溫度與凝膠強度關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)在凝膠化時間為3h的條件下，鯪魚魚糜凝膠化最適宜溫度在40℃左右，此時魚糜凝膠效果最好。汪之和等［14］研究了不同的加熱溫度、加熱時間和加熱方式對8種西非魚糜凍藏后凝膠特性的影響，結(jié)果顯示這些魚糜基本上在40℃加熱時具有較強的凝膠強度，60～70℃為凝膠劣化溫度段；采用40℃加熱20min后再在90℃加熱40min的二段加熱方式，可使魚糜制品具有較高的硬度、彈性和凝膠強度。本試驗采用二段加熱法，按1.2.2試驗方法，對二段加熱中第一階段的加熱溫度進行了研究，試驗結(jié)果見圖3。

由圖3可知，魚糜蛋白質(zhì)的凝膠強度隨著溫度的升高先升后降，在40℃時達到最大值，此時破斷強度為22.2N，相較于對照樣（破斷強度為19.8N）提高了12.1%。當溫度在30～45℃時，凝膠強度變化不是很明顯，超過45℃便大幅度地下降。這主要是因為魚糜加熱溫度在50～55℃，糖基化反應加熱條件不適，凝膠形成斷裂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝膠劣化現(xiàn)象，從而導致凝膠強度顯著降低。

圖3 不同加熱溫度對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響Fig.3 Effect of different heating temperatures on Gel strength of surimi protein

2.4 加熱溫度對魚糜凝膠持水力的影響

魚糜制品的品質(zhì)是通過其質(zhì)構(gòu)、色澤、風味來綜合評價的，其中最主要的是其質(zhì)構(gòu)特性。魚糜制品含有70%～80%的水分，其保水性對食品的口味、風味及質(zhì)構(gòu)特性有著非常明顯的影響。加熱溫度對蝦蓉制品凝膠持水力的影響試驗結(jié)果見圖4。

由圖4可知，魚糜蛋白質(zhì)持水力與凝膠強度呈正相關(guān)，都是隨著溫度的升高先升后降，在40℃時達到最大值，超過45℃持水力便大幅度地下降，當溫度為55℃時，持水力相較于40℃降低了1.8%。這是因為魚糜蛋白中存在一種對溫度敏感的蛋白

酶，在50～70℃活性最強，可以使已經(jīng)形成的肌球蛋白分子的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)劣化，疏水基團暴露，水分游離容易導致凝膠劣化［15］。因此，在實際二段加熱過程中，一段加熱溫度應控制在50℃溫度以下，進行緩慢凝膠化一段時間后，加熱使魚糜凝膠快速通過50～70℃凝膠劣化溫度帶，魚糜制品中心溫度快速達到90℃，使包含水分的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定下來，成為凝膠品質(zhì)較好的制品。

2.5 加熱時間對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響

圖4 不同加熱溫度對魚糜蛋白質(zhì)持水力的影響Fig.4 Effect of different heating temperatures on water-holding capacity of surimi protein

加熱條件和方式是影響糖基化技術(shù)提高魚糜蛋白質(zhì)凝膠性的關(guān)鍵因素。魚糜加熱的目的有2個：一是使蛋白質(zhì)與多糖進行充分的糖基化反應，使之形成的糖蛋白聚合物變性凝固，使魚糜凝膠化，將制品定型成一定的形狀，提高魚糜制品的凝膠特性；二是殺滅部分微生物。試驗結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，魚糜制品的凝膠強度在凝膠化溫度為40℃時，隨著凝膠化時間的延長有上升趨勢，并在凝膠化時間為60min時達到最大，此時破斷強度為22.2N，是對照樣（破斷強度為17.8N）的1.25倍，而后凝膠強度有下降趨勢。這與羅永康［16］所得的實驗結(jié)果相同。Alvarez等［17］報道了沙丁魚魚糜在凝膠化溫度為35℃時，隨著凝膠化時間的延長凝膠結(jié)構(gòu)的變化情況。在35℃時，沙丁魚魚糜的肌球蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，剛開始形成纖維束。隨著凝膠化時間的延長，纖維束之間的橫向交聯(lián)增多。在凝膠化時間為30～60min時，橫向交聯(lián)能增大魚糜的凝膠強度，但繼續(xù)延長凝膠化時間，橫向交聯(lián)的增多會不利于凝膠結(jié)構(gòu)，導致凝膠強度下降。

2.6 加熱時間對魚糜凝膠持水力的影響

加熱過程是魚糜制品生產(chǎn)中一個必不可少的重要環(huán)節(jié)，其作用是使擂潰中相互纏繞成纖維狀的鹽溶性肌動球蛋白溶膠及糖基化反應的糖蛋白以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定下來，把溶膠中的水分封閉在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，形成魚糜凝膠體，提高持水力。

圖5 不同加熱時間對魚糜蛋白質(zhì)凝膠強度的影響Fig.5 Effect of different heating time on Gel strength of surimi protein

由圖6可知，采取二段加熱法時，魚糜蛋白質(zhì)的持水力先隨著加熱時間的延長而增大，在第一階段加熱時間為60min時達到最大值，之后隨著時間的延長而降低。同時結(jié)合圖5也可看出，加熱時間在30～120min時，魚糜制品的凝膠強度和持水力相較于0 min得到了顯著的提高，即二段加熱法在增強凝膠性效果上明顯比一段加熱法好。因此，在實際生產(chǎn)中，采用在40℃加熱條件下加熱60min，再在90℃下加熱30min的二段加熱法，魚糜蛋白質(zhì)的凝膠性可以達到最好，時間過長和過短，都不適宜用糖基化反應來提高魚糜蛋白質(zhì)的凝膠性。

圖6 不同加熱時間對魚糜蛋白質(zhì)持水力的影響Fig.6 Effect of different heating time on water-holding capacity of surimi protein

3 結(jié) 語

以添加14%淀粉后魚糜制品物理性質(zhì)的相應檢測值（凝膠強度和持水力）為判斷依據(jù)，添加0.4%的殼聚糖，采用第一階段加熱溫度為40℃、加熱時間為60min，第二階段加熱溫度為90℃、加熱時間為30 min的二段加熱法具有較佳的效果。

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