卡潑肉瘤病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義

高建明 Erle S.Robertson▲

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北宜昌443002；2.美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，賓夕法尼亞費(fèi)城19104

卡潑肉瘤病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義

高建明1Erle S.Robertson2▲

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北宜昌443002；2.美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，賓夕法尼亞費(fèi)城19104

目的研究卡潑肉瘤病毒（Kaposis′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子（replica tion and transcription activator，RTA）調(diào)控宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義。方法突變Bcl-2啟動(dòng)子第1個(gè)與第2個(gè)CCN9GG樣序列，構(gòu)建了新的報(bào)告質(zhì)粒（命名為pGL3-△RRE1,2），用熒光素酶試驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證CCN9GG樣RTA反應(yīng)元件的功能。構(gòu)建RNA干擾慢病毒載體，篩選穩(wěn)定感染的BC3細(xì)胞，佛波酯誘導(dǎo)48 h后，分別用PCR、PI（碘化吡啶）染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒子DNA和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果突變第1個(gè)與第2個(gè)CCN9GG序列導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著降低；染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接相互作用。用RNA干擾技術(shù)抑制Bcl-2基因后，佛波酯誘導(dǎo)的KSHV陽性細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比凋亡率增加，病毒子產(chǎn)生減少。結(jié)論KSHV RTA能夠調(diào)控內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，延緩溶解性感染宿主細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)病毒子產(chǎn)生。

復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子；Bcl-2；表達(dá)上調(diào)；抗凋亡；溶解性感染

卡波肉瘤病毒（Kaposis's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子（replication andtranscriptionactivator，RTA）是ORF50編碼的一種即刻早期蛋白，是促使病毒從潛伏性感染向裂解性感染轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子。無論是外源性還是內(nèi)源性來源引起的RTA表達(dá)增高，均可介導(dǎo)病毒裂解性基因的級(jí)聯(lián)表達(dá)[1]。RTA主要通過兩種方式激活下游靶基因：一是直接與高親和性的RTA反應(yīng)元件（RTA responsive elements，RREs）結(jié)合[2]；二是間接地與細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，這些轉(zhuǎn)錄因子包括K-RBP[3]、CEBP-α[4]、Oct-1[5]和RBP-JК[6]等。RREs主要有兩類，一類富含AT堿基，另一類含有CCN9GG樣序列，這里N可以為任何堿基。例如，KSHV ORF57基因啟動(dòng)子含有這兩類RREs[2]。Bcl-2蛋白是一種定位于線粒體上的膜蛋白，為Bcl-2原癌基因所編碼，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能[7-8]。本研究探討KSHV RTA調(diào)控Bcl-2的分子機(jī)制及其在宿主細(xì)胞增殖與凋亡、病毒子的產(chǎn)生等方面的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pcDNA-RTA編碼全長(zhǎng)RTA的真核表達(dá)載體。pGL3-Bcl-2為含Bcl-2基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。pGL3-△P1是采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建的突變了Bcl-2基因P1啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒，構(gòu)建方法如下：先將啟動(dòng)子片段（-346～+1）插入pGL3載體MluⅠ/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處（pGL3-P2），再將片段（核苷酸-2 867～-1 545）插入pGL3-P2的MluⅠ/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處。pGL3-△RRE1、2是在pGL3-△P1基礎(chǔ)上突變了第1個(gè)和第2個(gè)CCN9GG RRE的報(bào)告質(zhì)粒，克隆所用引物見表1。

1.2 抗體與細(xì)胞

RTA抗體由上海巴斯德研究所藍(lán)柯實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Bcl-2小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH抗體購自Novus Biologicals公司，偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗購自Rockland公司。HEK 293是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒DNA的永生化細(xì)胞。BJAB為KSHV、EBVA均陰性的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，BC3和BCBL1是感染KSHV的人體腔淋巴瘤細(xì)胞系。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及KSHV的誘導(dǎo)

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser電穿孔儀進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用20 ng/mL佛波酯、1.5 mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)KSHV。所有細(xì)胞均在誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h收集。

表1 PCR擴(kuò)增及報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建的引物序列

1.4 Western blot

細(xì)胞收集后加入RIPA緩沖液裂解，用Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液上樣，聚丙烯胺凝膠電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF膜，用Bcl-2抗體、RTA抗體、GAPDH抗體及偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗進(jìn)行免疫印跡。用Odyssey紅外線成像系統(tǒng)（LI-COR公司）觀察結(jié)果。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

107個(gè)HEK 293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μg熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和10 μg RTA表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液。向40 μL細(xì)胞裂解液中加入25 μL熒光素酶試驗(yàn)底物，使用LMaxII384熒光光度計(jì)（Molecular Devices）檢測(cè)熒光水平。結(jié)果以3次試驗(yàn)值的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示。Western blot用來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.6 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

BCBL1細(xì)胞于佛波酯誘導(dǎo)48 h后向培養(yǎng)液中加入甲醛，終濃度為1%，37℃固定細(xì)胞10 min，使蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生交聯(lián)。加入甘氨酸使其終濃度為0.125 mol/L，在室溫下晃動(dòng)孵育5 min以終止交聯(lián)反應(yīng)。使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入含1%SDS的裂解液裂解細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞懸液將DNA均一地打斷成500～1 000 bp的片段。用ChIP稀釋緩沖液將超聲剪切后的DNA稀釋10倍，取20 μL稀釋液保存，這時(shí)的樣品標(biāo)記為INPUT，作為PCR的空白對(duì)照。其余稀釋液加入蛋白A瓊脂糖磁珠，4℃孵2 h，分為兩組，一組加入RTA抗體，4℃振蕩過夜，另一組加入鼠IgG抗體作為陰性對(duì)照。將免疫復(fù)合物用磁珠沉淀，將沉淀物分別經(jīng)低鹽、高鹽和氯化鋰溶液3次系列沖洗，然后用TE緩沖液洗2次，每次沖洗時(shí)間5 min。用新配制的洗脫緩沖液將蛋白/DNA復(fù)合物從磁珠上洗脫，加氯化鈉（Na+濃度為200 mmol/L）與2 μL RNaseA（0.5 mg/mL），65℃過夜，松解蛋白/DNA交聯(lián)；加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），于55℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收DNA片段為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，DNA的數(shù)量水平可通過定量PCR來檢測(cè)，引物見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物越過RRE1與EERE2區(qū)域，片段長(zhǎng)度為200 bp。同時(shí)做RT-PCR，用比較ΔΔCt值的方法對(duì)DNA豐度進(jìn)行相對(duì)定量。

1.7 RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)

Bcl-2基因小片段發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA，shRNA）用shBcl-2表示；對(duì)照shRNA以shC表示。它們均由Sigma公司合成[9]。pGIPZ是一種shRNA慢病毒載體，用來表達(dá)Bcl-2小片段發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA，購自O(shè)pen Biosystems。RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[10]。本研究中，筆者構(gòu)建了BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2細(xì)胞及其對(duì)照BC3-shC、BJAB-shC細(xì)胞。

1.8 病毒子DNA的PCR擴(kuò)增

BC3-shBcl-2、BC3-shC細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h，離心棄細(xì)胞，用0.45 μm孔徑的過濾器收集培養(yǎng)液上清，23 500 r/min離心20 min以沉淀病毒顆粒。加50 μL 0.2×PBS重懸病毒顆粒，放置95℃下15 min，加入1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）于56℃孵育1 h，95℃30 min滅活蛋白酶K。取5 μL病毒裂解液作模板，PCR擴(kuò)增KSHV編碼的K9。K9引物見表1。以BC3細(xì)胞中分離的KSHV基因組DNA為對(duì)照。PCR產(chǎn)物條帶的灰度用Kodak1D3.6軟件（Eastman）定量。

1.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是：凋亡細(xì)胞染色體降解、DNA碎片形成與可染性降低。收集細(xì)胞（106/mL）以1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃過夜。離心棄去固定液，PBS重懸細(xì)胞。加入終濃度50 μg/mL PI（Sigma公司）、1 μg/mL RNA酶于4℃下避光染色1 h。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）檢測(cè)細(xì)胞凋亡，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定6次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用FlowJo軟件（Tree Star），采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突變第1個(gè)與第2個(gè)CCN9GG RRE導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著降低

為進(jìn)一步驗(yàn)證CCN9GG RRE的功能，筆者將pGL3-△P1報(bào)告質(zhì)粒中的第1個(gè)和第2個(gè)CCN9GG RRE進(jìn)行了突變，得到了pGL3-△RRE1、2這一新的報(bào)告質(zhì)粒（圖1A）。熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明突變第1個(gè)與第2個(gè)CCN9GG RRE導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著降低（圖1B）。在沒有轉(zhuǎn)染RTA的293細(xì)胞，報(bào)告質(zhì)粒pGL3-△RRE1、2的熒光素酶活性與對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic都比較低；在轉(zhuǎn)染了RTA的293細(xì)胞，報(bào)告質(zhì)粒pGL3-△RRE1、2的熒光素酶活性約增加10倍，約為帶有9個(gè)完整CCN9GG RRE的pGL3-△P1報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性的1/3。預(yù)留部分細(xì)胞裂解液做Western blot檢測(cè)，以GAPDH作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染細(xì)胞RTA表達(dá)良好，表明轉(zhuǎn)染效率佳。

2.2 RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接相互作用

用佛波酯誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的BCBL1細(xì)胞進(jìn)行ChIP試驗(yàn)，表明RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接的相互作用。PCR擴(kuò)增證實(shí)免疫復(fù)合物中存在跨越第1個(gè)和第2個(gè)CCN9GG序列的DNA片段。在RTA抗體沉淀下來的經(jīng)誘導(dǎo)的核DNA組目的條帶清晰可見，在RTA抗體沉淀下來的未經(jīng)誘導(dǎo)的核DNA組無陽性信號(hào)，兩個(gè)IgG抗體陰性對(duì)照組亦均無陽性條帶（圖2A）。實(shí)時(shí)PCR用來相對(duì)定量沉淀下來的DNA的豐度，RTA抗體沉淀下來的經(jīng)誘導(dǎo)BCBL1細(xì)胞的核DNA量比對(duì)照組高8～32倍（圖2B）。

2.3 RTA介導(dǎo)的Bcl-2上調(diào)延緩溶解性感染的宿主細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)病毒子產(chǎn)生

RTA上調(diào)Bcl-2表達(dá)，Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要分子，因此筆者推測(cè)RTA介導(dǎo)的Bcl-2上調(diào)具有抑制宿主細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)病毒子產(chǎn)生的生物學(xué)功能。為驗(yàn)證此假設(shè)，筆者應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了Bcl-2抑制的穩(wěn)定細(xì)胞株（BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2）及對(duì)照細(xì)胞株（BC3-shC、B JAB-shC）。Western blot分析證實(shí)BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2細(xì)胞的Bcl-2蛋白的表達(dá)水平很低（圖3A）。BC3-shBcl-2、BC3-shC細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h，分離宿主細(xì)胞裂解產(chǎn)生的病毒子，以PBS重懸的病毒顆粒作模板，擴(kuò)增KSHV編碼的K9基因。結(jié)果顯示Bcl-2抑制細(xì)胞病毒子的產(chǎn)量約為對(duì)照組細(xì)胞的1/2（圖3B）。這表明RTA介導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞病毒子的產(chǎn)生。流式細(xì)胞儀分析顯示KSHV陰性細(xì)胞BJAB-shC與BJAB-shBcl-2細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率分別為62.4%、64.4%，二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KSHV陽性細(xì)胞BC3-shC與BC3-shBcl-2細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率分別為58.2%、71.5%（圖3C），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

Bcl-2家族成員調(diào)控著內(nèi)源性線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[11]。其中根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可將Bcl-2家族成員分為兩類，一類是具有抗凋亡功能，如：Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等，它們含有4個(gè)高度保守的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH 1-4）[12]；另一類具有促進(jìn)凋亡的功能，如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等，其中Bax、Bak含有BH 1-3，而Bid、Bad、Bim等僅含BH3結(jié)構(gòu)[13]。BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域。Bcl-2蛋白為Bcl-2原癌基因所編碼，不論在生理或病理?xiàng)l件下均具有抑制細(xì)胞凋亡的功能[7-8]。Bcl-2基因在許多腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)，不僅阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，而且是腫瘤化療、放療不敏感的重要原因[14-15]。

筆者前期研究[16]發(fā)現(xiàn)KSHV RTA能夠上調(diào)宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)。RTA可直接激活Bcl-2基因啟動(dòng)子，這種激活作用呈劑量依賴性，無細(xì)胞選擇性。CCN9GG RREs和P2啟動(dòng)子對(duì)RTA調(diào)控Bcl-2表達(dá)具有重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證CCN9GG樣RTA反應(yīng)元件的功能，闡明RTA調(diào)控Bcl-2的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義，筆者突變Bcl-2啟動(dòng)子第1個(gè)和第2個(gè)CCN9GG RRE，在pGL3-△P1基礎(chǔ)上構(gòu)建了pGL3-△RRE1、2這一新的報(bào)告質(zhì)粒。熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變第1個(gè)與第2個(gè)CCN9GG RRE導(dǎo)致RTA介導(dǎo)的Bcl-2啟動(dòng)子活性顯著降低。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明RTA蛋白與Bcl-2啟動(dòng)子中的RREs存在直接的相互作用。上述證據(jù)再次證明CCN9GG RRE對(duì)RTA反式激活Bcl-2具有重要的作用。用RNA干擾技術(shù)抑制Bcl-2基因后，佛波酯誘導(dǎo)的BC3-shB-cl2細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比凋亡率顯著增加，病毒子產(chǎn)生減少。

綜上所述，KSHV RTA介導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)上調(diào)促進(jìn)病毒的溶解性感染，可以延緩宿主細(xì)胞的凋亡，并增加病毒子的產(chǎn)生。

[志謝：衷心感謝Véronique Bourgarel-Rey（Aix-Marseille Université，Marseille Cedex 05，F(xiàn)rance）提供Bcl-2基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Bcl-2。]

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Molecular mechanism and biological significance of upregulation of cellular Bcl-2 by the KSHV encoded RTA

GAO Jianming1Erle S.Robertson2▲
1.Department of Pathophysiology,Three Gorges University School of Medicine,Hubei Province,Yichang443002,China; 2.Department of Microbiology,University of Pennsylvania School of Medicine,Philadelphia,Pennsylvania19104，United States of American

Objective To explore the molecular mechanism and biological significance of upregulation of cellular Bcl-2 by the KSHV(Kaposis's sarcoma-associated herpesvirus)encoded RTA(replication and transcription activator).Methods A new reporter plasmid named pGL3-△RRE1,2 was generated by deletion of the first and second CCN9GG-like sequences. Luciferase assay and chromatin immunoprecipitation(ChIP)analysis were carried out to further confirm the important role of CCN9GG RTA responsive elements(RREs).RNA interference lentiviral vector was constructed,and stablly infected BC3 cells were screened.At 48 h postinduction,cells were subjected to PCR,PI staining flow cytometry for virus progeny production and cellular apoptosis analysis.Results Mutation of the first and second CCN9GG RRE motifs I the Bcl-2 promoter dramatically diminished promoter activity.ChIP assay showed the direct interaction of RTA protein with CCN9GG RTA responsive elements.Furthermore,knockdown of cellular Bcl-2 using specific short hairpin RNA(shRNA)indicated that RTA plays an essential role in Bcl-2-mediated anti-apoptosis of the cell,promoting the production of virus progeny. Conclusion These findings provide an insight into the mechanism by which KSHV utilizes the intrinsic apoptosis signaling pathways for promoting the survival of lytically infected host cells to allow maximum production of virus progeny.

RTA;Bcl-2;Upregulation;Antiapoptosis;Lytic replication

R373

A

1673-7210（2012）11（a）-0012-04

2012-09-06本文編輯：谷俊英）

National Cancer Institute 5R01CA091792-08，5R01CA108461-05，1R01CA137894-01 and 1R01CA138434-01A209;National Institute of Allergy and Infectious Diseases 5R01AI067037-04 and National Institute of Dental and Craniofacial Research 5R01DE017338-03（to ESR）.

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