注射用頭孢呋辛鈉無(wú)菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證

李夏林 覃 曉

廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林 541002

注射用頭孢呋辛鈉無(wú)菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證

李夏林 覃 曉

廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林 541002

目的建立注射用頭孢呋辛鈉的無(wú)菌檢查方法。方法按《中國(guó)藥典》2010版二部附錄Ⅺ H“無(wú)菌檢查法”項(xiàng)下的要求，采用薄膜過(guò)濾法，接種至含有頭孢菌素酶的培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果方法驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品試驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好。結(jié)論本法能滿足注射用頭孢呋辛鈉無(wú)菌檢查的方法學(xué)要求。[關(guān)鍵詞]方法學(xué)驗(yàn)證；注射用頭孢呋辛鈉；無(wú)菌檢查

頭孢呋辛鈉屬β-內(nèi)酰胺類抗生素中的頭孢菌素類，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌和部分革蘭陰性桿菌均敏感?？捎糜诿舾芯碌暮粑栏腥尽⒍?、鼻、喉科感染、泌尿道感染、皮膚和軟組織感染、骨和關(guān)節(jié)感染、產(chǎn)科和婦科感染、淋病等[1]。根據(jù)《中國(guó)藥典》的要求，當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查[2]。現(xiàn)將注射用頭孢呋辛鈉的無(wú)菌檢查方法建立報(bào)道如下。

1 儀器與材料

HTY-2000A集菌儀、KDGB220和KDGB330集菌培養(yǎng)器，杭州高得醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種包括金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63501]、生孢梭菌 [CMCC（B）64941]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉菌 [CMCC（F）98003]，均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心，均為第3代。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。頭孢菌素酶凍干粉（500萬(wàn)U/支）杭州北望生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。注射用頭孢呋辛為國(guó)內(nèi)藥廠生產(chǎn)，規(guī)格為0.75 g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，分別于30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)24～48 h。分別取上述培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成50～100 cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于23～28℃培養(yǎng)5～7 d，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5 mL洗脫孢子，將孢子液移至比濁管中，于細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比較，取1 mL孢子原液用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成含孢子數(shù)50～100 cfu/mL的孢子懸液。各菌液計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 方法驗(yàn)證

取供試品6瓶用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液90 mL溶解，混勻，于集菌儀上通過(guò)一副KDGB220集菌培養(yǎng)器中的一聯(lián)濾筒中，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 mL，共5次，在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾，然后泵入100 mL培養(yǎng)基，并加入約500萬(wàn)U的頭孢菌素酶。在另一濾筒中泵入100 mL培養(yǎng)基，并加入等量的試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照。每種試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基同法逐一處理。另取一副KDGB220集菌培養(yǎng)器，分別泵入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基至兩個(gè)濾筒中，作為陰性對(duì)照。上述集菌培養(yǎng)器分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d。見(jiàn)表2。

表2 注射用頭孢呋辛鈉無(wú)菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 供試品測(cè)定

取供試品9瓶，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液140 mL溶解，混勻，于集菌儀上通過(guò)一副KDGB330集菌培養(yǎng)器中，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次300 mL，共5次，在其中兩管泵入各100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（其中一管接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照），另一管泵入100 mL的改良馬丁培養(yǎng)基，并在每管中加入約500萬(wàn)U的頭孢菌素酶。另取一副KDGB220集菌培養(yǎng)器，取上述溶劑和沖洗液同法操作，分并別泵入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照。將集菌培養(yǎng)器分別按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，逐日觀察并記錄，結(jié)果供試品管和陰性對(duì)照管均澄清，陽(yáng)性對(duì)照管在48 h內(nèi)菌生長(zhǎng)良好，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

表1 細(xì)菌和真菌計(jì)數(shù)結(jié)果（菌數(shù)為2個(gè)平皿的平均數(shù)，cfu/mL）

3 討論

頭孢呋辛鈉為頭孢菌素類廣譜抗生素，對(duì)敏感菌有較強(qiáng)的抗菌活性，故在該品種的無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ推茐钠淇咕钚?。作者在摸索該品種薄膜過(guò)濾法實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，在相同樣品量的情況下，曾采取僅用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗的方式，供試品試驗(yàn)管在規(guī)定時(shí)間內(nèi)有試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)的情況。而采取用含適量頭孢菌素酶的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗的方式，也存在某些供試品試驗(yàn)管的試驗(yàn)菌在規(guī)定時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)微弱、緩慢的情況，說(shuō)明這兩種方法均不能有效消除頭孢呋辛鈉的抗菌活性。只有采取本文中將適量頭孢菌素酶加入培養(yǎng)基的方法，使酶與藥品能充分地接觸，酶解作用完全，得以有效地滅活濾器中殘留頭孢呋辛鈉的抗菌活性，而且所需沖洗液的量和沖洗次數(shù)也較合適，從而確認(rèn)頭孢呋辛鈉在本文試驗(yàn)條件下方法的可靠性，可以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).臨床用藥須知：化學(xué)藥和生物制品卷（2010年版）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2011：650.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（二部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄104.

R917

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2095-0616（2012）11-88-02

2012-04-26）