乳腺癌耐藥蛋白BCRP表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系

張 瓊 譚小軍 鄭國沛

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東廣州 510095；2.廣州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東廣州 510095

乳腺癌耐藥蛋白BCRP表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系

張 瓊1譚小軍1鄭國沛2

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東廣州 510095；2.廣州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東廣州 510095

目的 探討乳腺癌組織中乳腺癌耐藥蛋白表達(dá)與臨床常用化療藥物敏感性之間的關(guān)系。 方法 選取42例乳腺癌組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測標(biāo)本中BCRP表達(dá)，對同一標(biāo)本應(yīng)用膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)進(jìn)行體外藥物敏感性試驗。 結(jié)果 乳腺癌組織中BCRP陽性表達(dá)率為33.33%（14/42），BCRP陽性表達(dá)者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組（P＜0.05）。 結(jié)論 BCRP蛋白表達(dá)可以作為預(yù)測化療效果的一個重要參考指標(biāo)，根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果進(jìn)行藥物篩選，實現(xiàn)乳腺癌化療的個體化，對于提高患者生存質(zhì)量，具有十分特殊的意義。

乳腺癌；乳腺癌耐藥蛋白；膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)

近年來我國乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，位居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌易于轉(zhuǎn)移至外周淋巴結(jié)，其復(fù)發(fā)率和死亡率較高。雖然現(xiàn)代外科學(xué)手術(shù)方法取得了極大進(jìn)展，但是對術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移尚缺乏有效手段。化療是一種重要的輔助治療方法，但腫瘤細(xì)胞多藥耐藥常導(dǎo)致化療失敗。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）與多種腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)[1]。本研究采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測乳腺癌標(biāo)本中BCRP表達(dá)，對同一標(biāo)本應(yīng)用膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（collagen gel droplet culture drug-sensitivity test，CD-DST）進(jìn)行體外藥物敏感性試驗，為優(yōu)化臨床乳腺癌治療方案提供有指導(dǎo)意義的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取筆者所在醫(yī)院2011年1～7月行乳腺癌根治術(shù)的42例乳腺癌患者作為研究對象。患者年齡23～78歲，平均（48.2±13.7）歲；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌35例，浸潤性小葉癌4例，其他類型3例；臨床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期23例、Ⅲ期11例、Ⅳ期3例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療、放療及免疫治療。

1.2 試劑和儀器

一抗為鼠抗人BCRP單克隆抗體，購自德國Merck公司，S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自北京鴻躍科技有限公司；紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺均購自國內(nèi)制藥廠。Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)（media cybernetics，USA）。

1.3 病理學(xué)檢查

乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定后，在肉眼所見腫瘤實體無出血壞死處取材后進(jìn)行脫水、包埋等常規(guī)組織學(xué)處理；石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚5 μm，一張HE染色后用于組織病理學(xué)的診斷，其余用于免疫組織化學(xué)分析。

1.4 方法

1.4.1 蛋白檢測 采用免疫組化S-P法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PBS代替一抗為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4.2 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) BCRP蛋白免疫反應(yīng)以胞膜和胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，結(jié)果判定采用Fromowitz[2]綜合計分法 ：（1）染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，呈淡黃色顆粒、明顯高于背景為1分，呈淺棕黃色顆粒為2分，出現(xiàn)大量深棕黃色顆粒為3分；（2）陽性細(xì)胞數(shù)評分：所有切片隨機(jī)觀察5個高倍視野（×400），計數(shù)500個細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞數(shù)比例的評分相加之和＜2為陰性（-），2～ 3分為弱陽性（+），4～ 5分為中度陽性（++），6～ 7分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4.3 CD-DST試驗 無菌條件下將新鮮乳腺癌標(biāo)本剪成0.5～1.0 mm組織碎塊，組織消化酶消化后篩網(wǎng)過濾，離心后去除上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。冰浴條件下制備膠原蛋-細(xì)胞混合溶液，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，參照各抗癌藥物血漿高峰濃度加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)不加藥空白對照孔。甲基紫染色，甲醛固定后，倒置顯微鏡拍照，并利用圖像分析軟件自動計算腫瘤細(xì)胞數(shù)量。

1.4.4 CD-DST結(jié)果判定 藥物處理組細(xì)胞數(shù)/空白對照組細(xì)胞數(shù)的百分比表示藥物體外敏感性，如果該百分比≤50%判定為藥物在體外敏感。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中BCPR的表達(dá)情況

乳腺癌組織中BCRP陽性表達(dá)率為33.33%（14/42）， 其中強(qiáng)陽性3例，中等強(qiáng)度陽性8例，弱陽性3例。見圖1。

圖1 BCRP在乳腺癌組織中的表達(dá)（SP，×200）

2.2 膠滴腫瘤藥敏檢測結(jié)果

BCRP陽性表達(dá)者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

迄今為止，乳腺癌的臨床治療仍然是以手術(shù)為主，輔以放療、化療和內(nèi)分泌治療等?；熞阅芸刂莆⑿∞D(zhuǎn)移，術(shù)前縮小原發(fā)灶，術(shù)后防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及失去手術(shù)機(jī)會的姑息治療等特點而在乳腺癌綜合治療中彰顯出不可替代的作用。但乳腺癌的多藥耐藥一直影響化療效果。多藥耐藥的形成機(jī)制復(fù)雜，涉及多個因素、多個環(huán)節(jié)及多條途徑，目前研究最深入的是ATP結(jié)合盒式（ATP binding cassette，ABC）超家族成員等膜轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增高而介導(dǎo)的多藥耐藥。BCRP是ABC超家族中的新成員，與典型的轉(zhuǎn)運蛋白不同的是只含有一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域，因此稱其為半轉(zhuǎn)運蛋白，主要通過水解ATP供能將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度從而導(dǎo)致耐藥[3]。本研究結(jié)果顯示，42例乳腺癌中BCRP蛋白陽性表達(dá)14例，陽性表達(dá)率為33.33%，與孫宇萍等[4]檢測60例臨床乳腺癌標(biāo)本組織中BCRP陽性表達(dá)率為35%基本相近。

近年來研究證明BCRP在白血病[5]、肺癌[6]等許多惡性腫瘤的多藥耐藥中扮演著重要角色。越來越多的實驗資料顯示，BCRP通過形成同源二聚體或異源二聚體在乳腺癌細(xì)胞對米托蒽醌、托普替康、5-氟尿嘧啶等多種藥物的耐受中發(fā)揮著重要作用[7-8]。袁建輝等[9]利用四環(huán)素（tetracycline，Tet）調(diào)控BCRP體外表達(dá)的鼠成纖維細(xì)胞PA317細(xì)胞模型（PA317/Tet on/TRE-BCRP）研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞BCRP表達(dá)的增加，PA317/Tet on/TRE-BCRP細(xì)胞對5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、多柔比星、 吡柔比星、依托泊苷、米托蒽醌等藥物的耐藥指數(shù)增高，并且經(jīng)5-氟尿嘧啶處理后細(xì)胞凋亡率隨之降低，證實了BCRP介導(dǎo)的5-氟尿嘧啶多藥耐藥機(jī)制除了將藥物“泵出”細(xì)胞外，還能增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡的耐受。顏紅柱等[10]報道，浸潤性乳腺癌中BCRP的表達(dá)與ER呈負(fù)相關(guān)。Imai等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ER陽性的乳腺癌細(xì)胞株中，雌激素能降低內(nèi)源性BCRP的表達(dá)，但在ER陰性的細(xì)胞中卻無此作用。Wakabayashi等[12]也發(fā)現(xiàn)雌二醇可以下調(diào)ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞中BCRP表達(dá)。但Ee PL等[13]報道，ER陽性的乳腺癌細(xì)胞株中雌激素可以誘導(dǎo)BCRP mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與前述研究結(jié)果相矛盾。以上結(jié)果表明，乳腺癌BCRP表達(dá)水平可能受雌激素－雌激素受體信號通路的影響，但其具體機(jī)制復(fù)雜，有待于進(jìn)一步探討。

本研究分析了乳腺癌組織中BCRP的表達(dá)與臨床常用乳腺癌化療藥物敏感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在BCRP陽性表達(dá)的14例患者中5-氟尿嘧啶和阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組，提示BCRP參與了乳腺癌對上述藥物多藥耐藥的形成。本研究結(jié)果表明，BCRP蛋白表達(dá)可以作為預(yù)測化療效果的一個重要參考指標(biāo)，為在BCRP陽性的乳腺癌患者化療中避免使用這些耐受藥物起到十分重要的指導(dǎo)作用。根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果進(jìn)行藥物篩選，實現(xiàn)乳腺癌化療的個體化，改觀化療效果，對于提高患者生存質(zhì)量和生存率、避免不必要的化療藥物副作用，具有十分特殊的意義。

表1 乳腺癌組織中BCPR表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系[n（%）]

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Correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and chemotherapy drugs sensitivity

ZHANG Qiong1TAN Xiaojun1ZHENG Guopei2
1.Department of Pathology,Guangzhou Medical University Cancer Hospital,Guangzhou 510095,China;2.Guangzhou Medical University Cancer Institute,Guangzhou 510095,China

ObjectiveTo explore the correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and the sensitivity to chemotherapeutic drugs commonly used in clinical.Methods42 cases of breast cancer tissue samples were selected. The expression of BCRP protein was detected in breast cancer tissues using S-P staining method. In vitro drug sensitivity tests were carried out on the same sample using collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST).ResultsThe positive expression rate of BCRP was 33.33%(14/42).Significantly higher 5-Fluorouracil and Adriamycinresistance rates were revealed in BCRP positive group than those in BCRP negative group (P＜0.05).ConclusionBCRP protein expression can be used as an important reference index for predicting the effect of chemotherapy. It is of special significance to implement individual breast cancer chemotherapy and improve the quality of life in patients with breast cancer according to the drug sensitivity test results.

Breast cancer;BCRP;CD-DST

R737.9

A

2095-0616（2012）11-12-03

廣東省廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（201102A213008）。

2012-04-10）