體外循環(huán)導致大鼠小腸微循環(huán)損傷的機制研究

吳海衛(wèi)，許 飚，景 華，王常田，錢建軍，董國華

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)過程中非生理性血流可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，造成各種器官功能損傷。小腸在SIRS發(fā)生發(fā)展中即是“靶”又是“源”，CPB后腸黏膜屏障功能的損害可以造成內(nèi)毒素入血、腸道菌群易位，從而觸發(fā)瀑布效應(yīng)，甚至引起多臟器功能障礙，影響臨床治療效果［1－2］。CPB引起腸道損傷的機制尚不清楚，本研究采用大鼠CPB模型，用熒光活體顯微鏡技術(shù)對小腸微循環(huán)變化進行直接觀察，定量分析腸壁血流灌注、血管通透性及白細胞附壁情況，探討CPB后腸道損傷的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組 采用450～550 g成年雄性SD大鼠，建立常溫CPB模型［3－4］。簡要步驟如下，大鼠麻醉后氣管切開接小動物呼吸機輔助通氣，吸入氧濃度100%。左股靜脈置22G套管針，接微量輸液泵，維持靜脈通道;右側(cè)頸動脈置24G套管針，連接動脈泵管，用于CPB動脈血泵入。右頸靜脈置入帶網(wǎng)狀側(cè)孔的16G穿刺導管，深入至右心房水平，引流靜脈血入貯血槽。全身肝素化(500 IU/kg)后開始轉(zhuǎn)流。靜脈血由右房經(jīng)頸靜脈管依靠重力和虹吸引出，引流到位于心臟平面下方30 cm的開放貯血槽，經(jīng)微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司，氣血交換面積0.05 m2，預充量4 ml)氧合，氧合血由小型蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT00－300M型)泵入右頸動脈。預充液由8 ml賀斯和8 ml供體血液構(gòu)成。在貯血槽和膜肺上方，用100W白熾燈照明加熱，以維持肛溫在36.5～38.3℃。逐漸增加流量，穩(wěn)定于100～150 ml/(kg·min)，維持平均動脈壓在60～80 mm Hg。轉(zhuǎn)流60 min后，逐步降低灌注流量并停機，依次拔除各管道。緩慢輸入貯血槽中的余血，維持循環(huán)穩(wěn)定。繼續(xù)輔助呼吸120 min并進行微循環(huán)觀察。20只大鼠隨機分為CPB組及對照組，每組各10只。兩組動物手術(shù)操作相同，CPB組連接CPB裝置并轉(zhuǎn)流60 min，對照組同樣連接裝置并肝素化但不轉(zhuǎn)流。

1.2 活體觀察方法 在觀察開始前，經(jīng)股靜脈分別注入異硫氰酸熒光素標記牛白蛋白(fluorescein isothiocyanate－bovine serum albumin，F(xiàn)ITC －BSA)(5%，0.2 ml/100 g)和吖啶橙(0.2%，0.1 ml/100 g)，其中FITC－BSA可以使血漿著色，以顯示腸壁毛細血管結(jié)構(gòu)，吖啶橙可以標記體內(nèi)白細胞，使其細胞核在鏡下呈現(xiàn)為發(fā)光亮點。做腹部正中切口，將末段回腸連同腸系膜輕輕拉出腹外，逆腸系膜方向縱形切開腸管約1 cm，以6－0單絲線縫于四周，舒展、固定于載玻片，置于觀察臺，連續(xù)用37～38℃生理鹽水表面灌流給腸壁保溫、保濕。黏膜及黏膜下層由通過切口由內(nèi)向外，漿膜層及肌層則直接從腸管外由外向內(nèi)進行觀察。采用熒光顯微鏡(上海2XC4TV型)進行活體觀察，用100W汞燈分別通過I2/3(綠色，波長530～560 nm)和 N2(蘭色，波長450～490 nm)濾色板頂部照明。分別于CPB前(T1)、CPB 30 min(T2)、CPB 60 min(T3)、CPB 后60 min(T4)、CPB后120 min(T5)對小腸微循環(huán)狀態(tài)進行顯微觀察，選定有代表性的4個不交叉區(qū)域經(jīng)行各項指標檢測，通過攝影、攝片記錄有關(guān)圖像資料，用Image J圖像分析系統(tǒng)做評估。

1.3 指標檢測

1.3.1 微循環(huán)血流動力學指標 選擇無分枝、長度100μm、直徑30μm左右的小動脈，測量其直徑變化;用逐禎回放分析技術(shù)，測量黏膜下層收集靜脈中的紅細胞流速;測量觀察區(qū)域內(nèi)熒光灌注毛細血管長度，分別計算肌層、黏膜層單位面積FITC－BSA灌注毛細血管的長度，即功能毛細血管密度(functional capillary density，F(xiàn)CD)，F(xiàn)CD 值以單位面積FITC－BSA灌注毛細血管的長度表示(/cm)。

1.3.2 毛細血管通透性 FITC－BSA分子量大，正常情況下不能通透血管壁而位于血管腔內(nèi)，當毛細血管通透性增加時，F(xiàn)ITC－BSA可穿過血管壁進入組織間隙，使血管周圍出現(xiàn)散在的不規(guī)則斑片狀熒光。利用計算機圖像處理技術(shù)，將其轉(zhuǎn)為255灰階圖時，可以表現(xiàn)為灰度值增加，其增加幅度與FITC－BSA的漏出程度呈正相關(guān)。通過測定微血管周圍的灰度值變化，可以定量了解血管壁的通透性情況，灰度值越高，則表示組織間的大分子物質(zhì)越多，血管通透性就越大。

1.3.3 白細胞浸潤情況 于高倍視野下找到黏膜下層清晰的毛細血管后微靜脈，通過攝像系統(tǒng)記錄白細胞的流動狀態(tài)。將靜止于血管內(nèi)皮＞30 s和游走于血管外但仍在小血管旁的白細胞認定為附壁狀態(tài)，對其計數(shù)，并計算100μm長度血管的附壁白細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 小動脈直徑 小動脈直徑自CPB開始后開始逐步下降，到觀察結(jié)束時最為明顯，從(30.8±3.6)μM降至(20.6 ±3.7)μm，差異顯著(P ＜0.001)，這種血管收縮與小血管的自律運動無關(guān)，見圖1。

2.2 小靜脈血流速度 CPB開始后小靜脈內(nèi)血流速度減慢，隨著CPB時間的延長，血流速度進一步降低。在T4和T5時小靜脈血流速度仍持續(xù)降低，從T1時的(1.38±0.08)mm/s降為至 T5時的(0.44 ±0.06)mm/s，見圖2。

2.3 功能毛細血管密度 對照組黏膜層毛細血管網(wǎng)豐富，絨毛內(nèi)小血管細而迂曲，結(jié)構(gòu)清晰;肌層毛細血管網(wǎng)在正常情況下呈規(guī)則矩形，毛細血管網(wǎng)豐富，顯影清晰，見圖3A。CPB狀態(tài)下可見到明顯的血管充盈減少，并有血管邊緣模糊表現(xiàn);轉(zhuǎn)流后120 min FITC－BSA灌注血管影明顯減少，并有相互之間的交通中斷現(xiàn)象，見圖3B。對照組肌層和黏膜層FCD值隨時間的延長無明顯變化，而CPB后則逐漸減少，至CPB后120 min時分別由從CPB前(511±17)/cm和(221±13)/cm降為(150±17)/cm和(64 ±7)/cm，差異顯著(P ＜0.001)，見圖4。

2.4 毛細血管通透性 對照組術(shù)后120min毛細血管輪廓清晰，F(xiàn)ITC－BSA局限于血管內(nèi)，血管周圍背影黑暗，見圖5A。CPB轉(zhuǎn)流開始后，隨時間延長可以見到逐步增多的血管外透亮區(qū)，在小腸黏膜層絨毛微血管和黏膜下層毛細血管后微靜脈中尤為明顯，至觀察結(jié)束時，個別小血管結(jié)構(gòu)變得模糊不清，邊界難以確認，見圖5B。定量分析則表現(xiàn)為小血管周圍灰度值的逐步增加，由開始時的(142±7)升至實驗結(jié)束時的(220±13)，有顯著統(tǒng)計學差異 (P＜0.001)，表明CPB后小血管通透性增加。見圖6。

2.5 白細胞浸潤情況 對照組毛細血管內(nèi)很少見到附壁白細胞，毛細血管內(nèi)偶見被吖啶橙染亮的白細胞顆粒，見圖7A，箭頭所示為停留于血管邊緣的白細胞，在吖啶橙染色下呈現(xiàn)桔紅色顆粒;而CPB組大鼠在轉(zhuǎn)流120 min后，附壁的白細胞數(shù)目明顯增加，以黏膜下層小靜脈內(nèi)最為突出，可見到許多的白細胞亮點聚集于小血管內(nèi)及血管周邊，見圖7B。定量分析顯示白細胞附壁數(shù)由CPB前(2.8±1.3)個/100 μM升至(30.3±1.3)個/100 μm，差異顯著(P ＜0.001)，見圖8。

3 討論

限于倫理道德方面的制約，對CPB所致胃腸道損傷及其在術(shù)后全身炎癥反應(yīng)中作用的研究，在人體上難以深入，大多限于臨床經(jīng)驗總結(jié)或間接測定，如:對術(shù)后消化系統(tǒng)并發(fā)癥的分析、Doppler超聲腹內(nèi)血管血流測定、動脈－胃黏膜pHi測定等，從而推斷胃腸道缺血及黏膜損傷程度，無法做到直接、定量分析，進一步的研究必須依賴適當?shù)膭游锬Ｐ停?－5］。本實驗建立大鼠CPB模型，采用活體熒光顯微鏡技術(shù)，對小腸微血管形態(tài)、管壁結(jié)構(gòu)完整性及血管內(nèi)的細胞運動狀態(tài)進行直接、定量觀察和分析研究。過去的研究常采用腸系膜作為微循環(huán)觀測對象，然而，腸系膜與腸壁內(nèi)的微血管在結(jié)構(gòu)分布和血流狀態(tài)上存在很大差別，且腸壁各層之間也有明顯不同［6－7］，因此，必須對腸壁各層(包括絨毛層、黏膜層、黏膜下層及肌層等)微循環(huán)直接觀測，才是判斷其損傷程度最直觀、有效的方法。

通過上述方法，我們發(fā)現(xiàn)，CPB可造成腸道缺血、血管通透性增加和炎性細胞浸潤等病理現(xiàn)象。CPB后小動脈管徑變細，伴隨著血流速度減慢，導致腸壁血供減少、灌注不足;FCD進行性下降，到觀察結(jié)束時，大約只有轉(zhuǎn)流前的30%，表明腸道存在血流重新分布，腸壁缺血的程度嚴重;白蛋白的外溢，顯示血管壁通透性增加，屏障功能受損，而周圍組織的水腫形成，可以進一步加重微循環(huán)損害;小靜脈內(nèi)聚集的附壁白細胞，可能是最早參與炎癥反應(yīng)的活化細胞，它們產(chǎn)生、釋放各種炎性介質(zhì)，破壞血管內(nèi)皮完整性，加重液體外滲，并在隨后的病理改變中伴演重要角色。研究還發(fā)現(xiàn)，毛細血管和黏膜下收集靜脈的改變最早、最明顯，是CPB損傷中最易受影響的結(jié)構(gòu)單元。而轉(zhuǎn)運毛細血管減少和腔內(nèi)淤滯，可以導致小腸肌層毛細血管灌注和營養(yǎng)紊亂，肌肉活力喪失或減少，最后導致腸麻痹［8］。

實驗中為了避免藥物作用的影響，未使用任何血管活性藥物，然而在這種狀態(tài)下，小腸微循環(huán)損傷的改變?nèi)匀环浅Ｃ黠@。因此，可以認為，CPB導致的小腸微循環(huán)缺血不僅僅是機體低灌注或低心排的結(jié)果，而非生理性轉(zhuǎn)流過程中的血流重新分配可能是最初的致傷原因［9］。值得注意的是，這種損傷在CPB結(jié)束后的2小時沒有任何緩解的征象，反而達到了高峰。這表明，CPB誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是腸道損傷最主要的機制，CPB過程盡管已經(jīng)停止，但炎癥反應(yīng)卻仍在繼續(xù)。CPB過程中血液和血細胞與體外管道人工表面接觸、泵的機械損傷、缺血再灌注損傷導致白細胞活化、炎性介質(zhì)釋放、血漿酶、補體活化、白細胞溢出、氧自由基釋放［10－11］，這些都可以直接或間接影響微循環(huán)，導致血管收縮，血液濃縮和血流淤滯，隨后內(nèi)皮細胞腫脹，阻塞血管，血管通透性增加，大分子滲漏。

總之，本研究利用大鼠CPB模型和活體熒光顯微鏡技術(shù)，直觀地研究了CPB所致小腸微循環(huán)進行性損傷的現(xiàn)象，初步揭示了其微觀病理生理機制。研究發(fā)現(xiàn)，在體循環(huán)狀態(tài)穩(wěn)定的情況下，常溫CPB可以導致大鼠明顯而持續(xù)的小腸微循環(huán)損傷，血流重新分配和炎性細胞浸潤可能是最主要的致傷因素。

［1］柴文祥，李剛，榮金明，等.體外循環(huán)心臟術(shù)后腹部并發(fā)癥臨床分析［J］.實用醫(yī)藥雜志，2009，26(09):1－4.

［2］董國華，景華，李德閩，等.體外循環(huán)術(shù)后消化系統(tǒng)功能障礙的臨床分析［J］.中國醫(yī)師雜志，2004，6(11):1498－1500.

［3］Dong GH，Xu B，Wang CT，etal.A ratmodelof cardiopulmonary bypasswith excellent survival［J］.JSurg Res，2005，123(2):171－175.

［4］黃海嶸，王常田，申翼，等.體外循環(huán)后大鼠肝損傷的研究［J］.醫(yī)學研究生學報，2009，22(1):5.

［5］李志浩，蘇肇伉，陳冬英，等.小兒先天性心臟病術(shù)后腸道通透性的研究［J］.中國體外循環(huán)雜志，2007，5(1):7－10.

［6］Rimpilainen R，VakkalaM，Rimpilainen E，etal.Minimized and conventional cardiopulmonary bypass damage intestinalmucosal integrity［J］.Scand Cardiovasc J，2011，45(4):236 －246.

［7］林寶泉，王軍，王強，等.中低溫停循環(huán)經(jīng)下腔靜脈逆灌對豬腸系膜微循環(huán)的影響［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，09(1):36－39.

［8］Beuk RJ，Tangelder GJ，Maassen RL，et al.Leucocyte and platelet adhesion in different layers of the small bowel during experimental totalwarm ischaemia and reperfusion［J］.Br JSurg，2008，95(10):1294 －1304.

［9］Dong GH，Wang CT，Li Y，et al.Cardiopulmonary bypass induced microcirculatory injury of the small bowel in rats［J］.World JGastroenterol，2009，15(25):3166 －3172.

［10］Geissler HJ，F(xiàn)ischer UM，Grunert S，etal.Incidence and outcome ofgastrointestinal complications after cardiopulmonary bypass［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2006，5(3):239 －242.

［11］劉小雄，彭金華，徐建軍，等.谷氨酰胺對體外循環(huán)患者腸道保護作用的臨床研究［J］.中國體外循環(huán)雜志，2007，5(1):11－13.