大黃素對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

秦春妮，黑飛龍，吳 蓓，王世磊，陳蒙蒙，龍 村

大黃素的化學(xué)名稱為1，3，8－三羥基－6－甲基蒽醌，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，是中藥大黃的主要有效單體之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明大黃素有抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗病毒、保護(hù)肝腎、改善微循環(huán)等作用［1］。本研究采用大鼠腸缺血再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)模型，了解大黃素對(duì)腸I/R損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，由阜外心血管病醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，術(shù)前4 h禁飲。

1.2 藥品與試劑 大黃素化學(xué)對(duì)照品購于中國藥品生物制品檢定所(批號(hào)110756－200110);大鼠TNF－α、內(nèi)毒素、IFABP酶聯(lián)免疫試劑盒由美國RD公司提供;羧甲基纖維素鈉由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.3 儀器 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，半自動(dòng)洗板機(jī)，減壓干燥箱，低溫離心機(jī)，－70℃低溫冰箱。

1.4 動(dòng)物模型制備與分組 將36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分為假手術(shù)組(A組)，缺血再灌注組(B組)和大黃素灌胃預(yù)處理組(C組)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，上腹部正中切口入腹，鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈(superiormesenteric artery，SMA)根部，A組術(shù)前2 h給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液按10 ml/kg灌胃，只分離SMA，然后縫合腹部傷口，B組術(shù)前及術(shù)中處理同A組，分離SMA，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉SMA根部，待確定SMA血流被完全阻斷后(腸壁色澤灰白，系膜血管無搏動(dòng))，縫合傷口，夾閉1 h后松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)SMA血流灌注1 h。C組給予大鼠濃度為20 mg/kg的大黃素灌胃，手術(shù)操作同B組。

1.5 標(biāo)本采集與處理 在灌胃前和缺血1 h時(shí)各取股靜脈血1 ml，再灌注1 h后取下腔靜脈血1 ml，A組在對(duì)應(yīng)各時(shí)點(diǎn)取血。采集的血樣立刻離心分離血清分裝后置于－70℃冰箱中保存，用于生化指標(biāo)的檢測。

1.6 檢測指標(biāo)與方法 大鼠血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)和內(nèi)毒素的測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，加樣孵育后經(jīng)過洗板、加二抗、洗板、加濃縮酶聯(lián)物(HRP)、洗板、加顯色液避光反應(yīng)后加終止液完成反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)在450 nm處進(jìn)行測量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析，組內(nèi)比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血清中IFABP的含量在小腸缺血1 h及再灌注1 h后，B組和C組的含量均高于A組(P ＜0.05)，但C組與A組相比沒有顯著差異。血清中TNF－α的水平在小腸缺血1 h和再灌注1 h后，B組高于A組(P＜0.05)，C組與A組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在再灌注1 h后，C組水平與B組相比明顯下降(P ＜0.05)。

血清中內(nèi)毒素水平在小腸缺血1 h及再灌注1 h后，B組與A和C組相比升高(P ＜0.05)，而C組與B組相比，C組血清中內(nèi)毒素水平明顯低于B組(P＜0.05)。各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清IFABP、TNF－α、內(nèi)毒素濃度測定結(jié)果見表1。

3 討論

體外循環(huán)心臟手術(shù)后胃腸并發(fā)癥的發(fā)生率約為0.5%～4.0%，但病死率卻高達(dá)26%～75%，常見表現(xiàn)為胃腸道出血、消化性潰瘍、缺血性腸炎和胰腺炎等［2－4］。發(fā)生的主要原因包括體外循環(huán)期間消化道低血流灌注、炎性介質(zhì)的釋放以及栓塞等，這些因素導(dǎo)致胃腸道缺血缺氧、組織水腫進(jìn)而造成胃腸組織損傷。因此尋找有效的胃腸保護(hù)方法尤顯重要。

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IFABP存在于小腸成熟腸上皮細(xì)胞胞液中，通常情況下IFABP血清中的含量極低，當(dāng)遭受缺氧、缺血、再灌注損害時(shí)細(xì)胞膜通透性增大，IFABP分子通過毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管進(jìn)入血液，目前研究認(rèn)為IFABP是早期診斷腸缺血的一個(gè)敏感指標(biāo)，其含量水平的變化與創(chuàng)傷、嚴(yán)重程度和腸道功能障礙程度呈正相關(guān)［5－7］。臨床研究表明小腸缺血早期，血清和尿液中IFABP即升高，切除缺血壞死腸段后，IFABP可以恢復(fù)正常，通過IFABP診斷小腸缺血性損害敏感度接近100%，Boord［8］也研究認(rèn)為血清IFABP對(duì)小腸缺血性損害有重要提示和鑒別診斷作用。本研究中B組和C組血清中IFABP的含量在缺血1 h時(shí)和再灌注1 h后明顯高于A組，說明腸I/R可引起IFABP升高，但C組與A組相比沒有顯著差異，提示大黃素具有一定的腸損傷保護(hù)作用，大鼠腸缺血再灌注后引發(fā)了腸通透性的改變，大黃素可在一定程度上阻止這個(gè)損傷效應(yīng)。

腸I/R損傷的過程中，機(jī)體單核、巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，釋放大量TNF－α，然后誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)生成，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并造成炎性介質(zhì)的大量釋放，致使腸損傷，而胃腸道是TNF－α的最主要靶器官，腸I/R可致腸組織TNF－αmRNA表達(dá)明顯增高［9］。本研究中B和C組血清中TNF－α的含量在缺血1 h時(shí)明顯高于A組，說明I/R使TNF－α釋放增多，而再灌注1 h后C組TNF－α水平與B組相比存在顯著差異，而與A組差異不明顯，提示大黃素對(duì)TNF－α分泌可能有抑制作用，表明大黃素具有胃腸保護(hù)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)［10］，大黃素對(duì)在脂多糖刺激下引起的單個(gè)核細(xì)胞釋放因子有明顯抑制作用，而且還可以抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF－α、IL－1、IL－6、IL－8等炎性因子的分泌，從而進(jìn)一步影響免疫激活的后續(xù)反應(yīng)環(huán)節(jié)。劉瑞林等［11］研究也發(fā)現(xiàn)大黃素預(yù)處理后缺血再灌注的大鼠血清中TNF－α水平明顯降低，腸系膜淋巴組織細(xì)菌移位率也顯著下降，認(rèn)為大黃素對(duì)于大鼠腸缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中脂多糖成分，以腸桿菌屬的細(xì)胞壁多見，腸道是體內(nèi)最大的內(nèi)毒素庫，但由于腸屏障功能完整，內(nèi)毒素很難進(jìn)入血循環(huán)，當(dāng)腸屏障功能受損時(shí)，內(nèi)毒素就會(huì)穿過腸黏膜進(jìn)入血循環(huán)，形成內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素可引起黏膜水腫，腸絨毛頂部細(xì)胞壞死。本研究發(fā)現(xiàn)B組和C組大鼠血清中內(nèi)毒素的含量在缺血和缺血再灌后均比A組高，說明腸I/R存在黏膜屏障損害，而C組與B組相比，C組血清中內(nèi)毒素水平明顯低于B組，提示大黃素對(duì)腸I/R損傷有一定的保護(hù)作用，可能是通過減少內(nèi)毒素的生成和釋放入血來發(fā)揮保護(hù)作用。

大黃素主要的藥理作用包括抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、改善微循環(huán)等。本研究表明缺血再灌注損傷可造成腸黏膜的損傷，如術(shù)前使用大黃素則可通過改善組織微循環(huán)、抑制炎性反應(yīng)而對(duì)腸黏膜產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。

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