劉 哲,雷鈞濤
(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林省 吉林市 132013)
近年來(lái)肺纖維化發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢(shì),研究表明肺纖維化與機(jī)體免疫能力下降以及肺間質(zhì)組織受到損害有直接關(guān)系[1]。另外,有報(bào)道稱(chēng)重癥非典型性肺炎,即SARS也和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活程度有關(guān)[2-3]。
補(bǔ)體系統(tǒng)作為人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一,可以抵御外來(lái)微生物侵害,并且在維持機(jī)體平衡等生理過(guò)程方面起著重要作用[4]。目前臨床廣泛應(yīng)用的抗補(bǔ)體活性藥物大多為非天然產(chǎn)物類(lèi)補(bǔ)體抑制劑,長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生各種副作用,且治療費(fèi)用昂貴以及在適應(yīng)證選擇等方面存在諸多問(wèn)題。徐晗、章蘊(yùn)毅等[5]報(bào)道稱(chēng),近年來(lái)在天然產(chǎn)物中分離出的多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的抗補(bǔ)體活性成分中,以多聚糖化合物和糖基化蛋白為多,通過(guò)體外抗溶血實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝Y選出生物活性較好的一些化合物。植物藥中廣泛存在具有抗補(bǔ)體作用的活性成分,多糖作為主要活性成分之一具有顯著的抗補(bǔ)體活性。研究表明,在許多中草藥中含有多糖成分,其中大多數(shù)為酸性雜多糖,而組成其酸性部分多為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸[6],它們對(duì)補(bǔ)體活性起到一定的調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制是在補(bǔ)體蛋白上存在識(shí)別點(diǎn),可以識(shí)別多糖的結(jié)構(gòu),從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)[7]。因此,以植物藥中多糖用作新型補(bǔ)體抑制劑的研究與開(kāi)發(fā),日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。
東北作為我國(guó)中藥的重要產(chǎn)區(qū)之一,中草藥資源豐富。許多中草藥在經(jīng)多年臨床應(yīng)用后,證明具有較好的抗過(guò)敏、消炎和免疫調(diào)節(jié)作用,這就為從中尋找有效抗補(bǔ)體活性成分提供了可能。本文選取桔梗、桑皮、杏仁等多種東北道地藥材,通過(guò)采用體外溶血試驗(yàn)考察其總抗補(bǔ)體活性,為天然藥物抗補(bǔ)體活性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
本文選取蒼術(shù)、桔梗、桑皮、杏仁、前胡、獨(dú)活等16種東北道地藥材,經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定均為正品。藥材粉碎過(guò)40目篩,備用。
α-萘酚、CaCl2、EGTA、MgCl2、NaCl、NaOH、95%乙醇、乙醚、苯酚、巴比妥鈉、巴比妥、丙酮、硫酸、三氯醋酸、枸櫞酸鈉等均為分析純。
R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(步琪,瑞士);TD-5A型低溫高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);Well scan MK3型酶標(biāo)儀(Thermo Labsyst,芬蘭);TH2-0型恒溫振蕩器(北京浪華時(shí)代科技發(fā)展有限公司);Freezedryerl8型冷凍干燥器(Labconco公司,美國(guó))。
豚鼠(200~250g),雌雄不限,吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
實(shí)驗(yàn)采用乙醇滲漉提取。取每種藥材10g,煮沸3次,煮沸后將母液合并、濃縮,用三氯醋酸在4℃下脫蛋白;離心后,取上清液用NaOH中和,流水透析48h;濃縮,經(jīng)乙醇沉淀;沉淀冷凍干燥得粗多糖[8]。
2.2.1 溶液配制
配制5倍濃縮巴比妥緩沖液(5×BBS),使用時(shí)稀釋成巴比妥緩沖液(BBS)。2%羊紅細(xì)胞(SRBC):取綿羊血2mL,用BBS洗滌,后以800r·min-1離心3min,重復(fù)3次,再以3000r·min-1離心10min,然后用BBS配制成2%SRBC。1000溶血素:用BBS配制成1∶1000溶血素溶液。
供試溶液:分別稱(chēng)取上述各供試藥材粗多糖4mg。用BBS超聲溶解成1∶1溶液,濃度為5mg·mL-1;分別加BBS稀釋?zhuān)瞥?∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128共8個(gè)濃度的供試品溶液。
2.2.2 補(bǔ)體制備及效價(jià)測(cè)定
取豚鼠股動(dòng)脈血10mL,4℃放置,凝固1h,以800r·min-1離心5min,取血清,加2mL 2%SRBC,混勻后,以800r·min-1離心5min,取上清作為補(bǔ)體分裝,置-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
補(bǔ)體經(jīng)典溶血系統(tǒng)的建立:取補(bǔ)體0.1mL,加入BBS配制成1∶10溶液,再用BBS分別以1/2倍稀釋?zhuān)渲瞥?∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280溶液。分別取1∶1000溶血素、各濃度補(bǔ)體、2%SRBC各0.1mL,溶于0.3mL BBS中混勻,于37℃水浴中加熱30min,4℃條件下以5000r·min-1離心10min。分別取上清0.2mL,在405nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組(0.1mL 2%SRBC溶于0.5mL蒸餾水中),詳見(jiàn)表1。以蒸餾水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算溶血率。以補(bǔ)體稀釋倍數(shù)為X軸,溶血百分率為Y軸作圖。選擇達(dá)到高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度。
表1 補(bǔ)體經(jīng)典途經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)中所加各成分的體積(mL)
2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定
取確定臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻,按照表1加入適量BBS、溶血素和2%SRBC,于37℃水浴加熱30min,4℃條件以5000r·min-1離心10min,分別取上清0.2mL,用酶標(biāo)儀在405nm下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置多糖對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組。以供試品濃度作為X軸,溶血抑制率作為Y軸作圖。
將5個(gè)不同批次稀釋補(bǔ)體加入溶血體系中,評(píng)價(jià)其效價(jià)。在補(bǔ)體稀釋濃度為1∶10~1∶40時(shí),溶血率接近100%,體系基本達(dá)到全溶血。因此以稀釋比例為1∶40的豚鼠血清作為以下經(jīng)典途徑篩選實(shí)驗(yàn)中所使用的補(bǔ)體,見(jiàn)圖1。
圖1 經(jīng)典途經(jīng)不同稀釋度的豚鼠血清的效價(jià)(%,n=5)
根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下,對(duì)16種藥材的抗補(bǔ)體活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明供試藥材中蒼術(shù)的最大溶血抑制率最高,為98.2%,超過(guò)相應(yīng)濃度肝素的最大溶血抑制率,表明抗補(bǔ)體活性良好??嘈尤实绕渌┰囁幉牡淖畲笕苎种坡拭黠@偏低,表明體外抗補(bǔ)體活性不佳。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。
圖2 供試藥物抗補(bǔ)體活性
圖3 供試藥物抗補(bǔ)體活性
目前臨床應(yīng)用非天然產(chǎn)物類(lèi)補(bǔ)體抑制劑治療各種肺纖維化,雖然對(duì)該病起到一定的治療作用,但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)降低機(jī)體的防御機(jī)能,可產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥。傳統(tǒng)中藥中大多數(shù)活性成分可以直接被機(jī)體消化吸收,說(shuō)明從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)出高效、低毒的補(bǔ)體抑制劑是可能的。此外,從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)的補(bǔ)體抑制劑還具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。
本文通過(guò)對(duì)東北16種道地藥材進(jìn)行體外溶血試驗(yàn),旨在篩選出具有一定抗補(bǔ)體活性的天然藥物。結(jié)果顯示在供試藥材中藥物濃度在0.08mg/mL時(shí),蒼術(shù)的溶血抑制率最大,活性較好,為進(jìn)一步研究天然藥物在治療肺纖維化、開(kāi)發(fā)高效低毒天然補(bǔ)體抑制劑奠定基礎(chǔ)。
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