RNAi研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)展

胡 衛(wèi)，王 泉，方肇勤

（1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203）

肝癌是我國(guó)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)的肝癌患者約占全球總患者數(shù)的55%，其相關(guān)死亡率排名第二，僅次于肺癌［1］。迄今為止針對(duì)肝癌的治療缺乏行之有效的方法，應(yīng)用最多的手術(shù)切除肝癌，其5年的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率十分高，死亡率也居高不下［2］。肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有一系列基因參與調(diào)控，它涉及到細(xì)胞基因改變、侵襲力、黏附能力、產(chǎn)生局部血凝因子或血管生成的能力、分泌代謝功能以及腫瘤細(xì)胞與宿主、腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)之間相互關(guān)系的多步驟、多因素參與的過(guò)程［3］。RNA 干擾（RNAi）是由雙鏈 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起的廣泛存在于動(dòng)植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而抑制其相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。近年RNAi已被認(rèn)為是真核生物基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，由于其具有高效性、高特異性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，已成為基因功能研究的有力工具，廣泛應(yīng)用于闡述包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的分子機(jī)制，為可能的基因治療和藥物治療提供依據(jù)。近年來(lái)在肝癌研究中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制相關(guān)基因表達(dá)后，再檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，揭示了肝癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)理。

1 肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制

肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)涉及細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、機(jī)體免疫與腫瘤血管生成等環(huán)節(jié)，其分子機(jī)制主要有：與侵襲相關(guān)的抑癌基因的失活和癌基因的表達(dá)增加、與轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)的細(xì)胞因子及其受體表達(dá)水平的變化、基質(zhì)金屬蛋白酶異常表達(dá)、腫瘤微血管密度的影響等。

2 肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)基因的RNAi

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大批與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，如H－ras基因、Bmi－1基因、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因、p53基因等。

2.1 H－ras基因

H－ras基因定位于11p15.5，由于它編碼的蛋白質(zhì)分子量為21kb，又被稱為p21分子。在原發(fā)性肝癌中，H－ras癌基因mRNA及蛋白質(zhì)水平均有明顯升高。Wang等［4］應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將H－ras基因?qū)肴烁伟┘?xì)胞株SMMC－7721，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染H－ras的細(xì)胞粘附能力提高、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)及cⅣase、EGFR表達(dá)增加，且上述變化與p21的表達(dá)顯著相關(guān)，表明H－ras癌基因能在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型的產(chǎn)生，提高肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。由于突變的H－ras基因與正常的H－ras基因堿基序列不同，利用RNAi的特異性可對(duì)突變的H－ras基因進(jìn)行針對(duì)性抑制。有學(xué)者將H1啟動(dòng)子嵌入到MSCV病毒載體中組成siRNA載體，成功地抑制了ras基因的表達(dá)［5］。

2.2 CXCR4

趨化因子受體CXCR4（chemokine receptor4，CXCR4）是組織表達(dá)最為廣泛的趨化因子受體之一，在肝癌中的高表達(dá)與其細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中都有很重要的作用［6］。夏斌等［7］將構(gòu)建的靶向CXCR4的siRNA真核表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞SMMC7721后，發(fā)現(xiàn)干擾組能明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

2.3 Rho－C基因

Rho－C（Ras homologous C）基因是 Rho家族的一個(gè)成員，參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)、增殖和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，在多種腫瘤尤其是轉(zhuǎn)移侵襲性強(qiáng)的腫瘤中表達(dá)增高［8］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Rho－C與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移表型的獲得有密切關(guān)系［9］。有研究［10］用 Rho－C－siRNA 真核表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染SK2－Hep1肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞中Rho－C蛋白表達(dá)水平降低達(dá)60%，細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)能力及體外侵襲能力均降低。ZHENG等［11］用Rho－C基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Bel7402，以沉默Rho－C基因表達(dá)，結(jié)果顯示Rho－C基因沉默能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞Bel7402凋亡并抑制細(xì)胞遷移和非錨定生長(zhǎng)能力。

2.4 OPN基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因定位在人類基因組的4q13，它與腫瘤及原癌基因的調(diào)控密切相關(guān)。OPN含有與細(xì)胞粘附有關(guān)的精氨酸－谷氨酸－天冬氨酸（RGD）序列，并通過(guò)受體CD44、整合素等來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的趨化、粘附和遷移。Ye等［12］報(bào)道OPN在轉(zhuǎn)移性、高侵襲性的肝癌中過(guò)表達(dá)。在試驗(yàn)中敲除掉OPN特異性抗體的細(xì)胞，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是植入裸鼠后，很快發(fā)生了轉(zhuǎn)移。溫敏杰等［13］的研究也證實(shí)了RNA干擾降低OPN的表達(dá)后，肝癌裸鼠移植瘤的體積和質(zhì)量明顯縮小。

2.5 HMGA1

HMGA1（High mobility group A1，高遷移率族蛋白A1）是位于細(xì)胞核內(nèi)的小分子非組蛋白，參與細(xì)胞多種重要生物學(xué)過(guò)程。HMGA1在胚胎期表達(dá)豐富，而在成熟組織中則表達(dá)極少或缺失。在病理情況下，相當(dāng)多的惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)有HMGA1的高水平表達(dá)，并且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)［14，15］。朱明光等［16］成功建立了基因沉默HMGA1穩(wěn)定細(xì)胞株；HMGA1基因沉默后，細(xì)胞增殖與質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組相比顯著降低，細(xì)胞凋亡百分率明顯升高。

2.6 c－Met

原癌基因c－met編碼的跨膜蛋白c－Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的單一受體。大量的證據(jù)表明，HGF／c－Met信號(hào)通路異常在人類各種腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，該通路的內(nèi)源及外源抑制劑引起了人們的廣泛關(guān)注。謝斌等［17］探討了c－Met－siRNA對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)和侵襲的影響，將構(gòu)建好的c－Met－siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染靶細(xì)胞 MHCC97－H后發(fā)現(xiàn)，目的基因的表達(dá)量顯著降低，且細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及侵襲均受到明顯抑制。

2.7 CDC25B

CDC25B（cell division cycle 25B）是CDC25激酶家族的最重要成員，貫穿細(xì)胞周期的各階段，其在細(xì)胞周期各期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。過(guò)量CDC25B可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Xin等［18］通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化染色方法證實(shí)CDC25B在肝癌組織表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，并將針對(duì)CDC25B基因的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株Hep3B和Hep40后，顯著抑制CDC25B基因表達(dá)（90%），同時(shí)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，將細(xì)胞阻滯在G2期，在接種Hep40的裸鼠身上也發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

2.8 Bmi－1

原癌基因 Bmi－1（B cell－specific moloney murine leukeria virus insertion site－1）是多梳基因家族（polycomb group genes，PcG）的成員之一，在細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞自我更新、分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［19，20］。目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道Bmi－1在多種腫瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散相關(guān)［21］。李小磊等［22］將針對(duì)Bmi－1基因序列特異性的Bmi－1－siRNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株MHCC97－H，發(fā)現(xiàn)沉默Bmi－1基因表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞株MHCC97－H的侵襲遷移力。

2.9 P53

野生型P53是一種抑癌基因，與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系密切［23］。在同時(shí)表達(dá)野生型P53和點(diǎn)突變P53的細(xì)胞中，RNA序列能特異地抑制突變型P53的表達(dá)，并在一定程度上恢復(fù)野生型基因P53的表達(dá)和功能［24］。有人［25］將外源性 P53dsRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌 SK－Hep－l細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)P53dsRNA可明顯抑制P53和部分抑制P21蛋白的表達(dá)，并明顯促進(jìn)SK－Hep－1細(xì)胞的增殖。

2.10 ICAM－1

血清可溶性細(xì)胞間粘附分子－1（Serum Intercellular Adhesion Molecule－1，sICAM－1）屬于免疫球蛋白超家族成員，它不僅參與免疫效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別，而且在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。廖維甲等［26］成功構(gòu)建了針對(duì)該基因的pGenesil－1／ICAM－1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Bel－7402和HepG2，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中ICAM－1基因表達(dá)抑制情況。結(jié)果表明經(jīng)特異性siRNA作用后肝癌細(xì)胞中ICAM－1基因的表達(dá)受到抑制，同時(shí)細(xì)胞增殖受到抑制。

2.11 Hpa

Hpa（heparanase，肝素酶）是一種β－D－葡萄糖苷酸內(nèi)切酶，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成過(guò)程中起重要作用。檀英霞等［27］將脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的2個(gè)Hpa－shRNA真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2（高表達(dá)Hpa），將干擾組和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞接種到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)干擾后的HepG2細(xì)胞中Hpa mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低，干擾組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯變慢。

2.12 VEGF

VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）具有強(qiáng)大的刺激血管生成能力，可增加微血管的通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂以及增加組織因子和一些蛋白酶的產(chǎn)生，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。蔣冬貴等［28］將自主構(gòu)建的pcDUVEGF－1和pcDUVEGF－2以及體外合成的 TWvegf－1和 TWvegf－2siRNA片段轉(zhuǎn)染肝癌Hep－3B細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后VEGF的 mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果兩種RNA干擾的方法均能顯著抑制VEGF基因mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.13 ezrin

骨架蛋白的重排是引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加，腫瘤早期轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。ezrin（膜－細(xì)胞骨架聯(lián)接蛋白）作為ERM蛋白家族的成員，是一種胞膜與細(xì)胞骨架的聯(lián)接蛋白。張巖等［29］先檢測(cè)ezrin和骨架蛋白在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，再選取高轉(zhuǎn)移潛能SF7721和MHCC97－H細(xì)胞系為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)RNA干擾可下調(diào)這兩個(gè)細(xì)胞系中ezrin蛋白的表達(dá)，并且使其增殖和侵襲能力均顯著下降。

3 展望

RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其分子生物學(xué)機(jī)制和功能的初步闡明，為成功地應(yīng)用RNAi從基因水平研究肝癌提供了理論基礎(chǔ)，為肝癌的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。隨著RNAi技術(shù)的迅速發(fā)展。有關(guān)肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的多基因、多位點(diǎn)研究取得了豐碩成果，充分顯示了RNAi在肝癌研究中的巨大潛力和廣闊的應(yīng)用前景。RNAi研究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)功能，少見(jiàn)系統(tǒng)深入的研究報(bào)道，都是針對(duì)某個(gè)與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，構(gòu)建載體研究其表達(dá)下調(diào)后對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，均沒(méi)有進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。此外，目前對(duì)RNAi沉默目的基因后基因功能的檢測(cè)，沒(méi)有形成一套容易操作且能明確體現(xiàn)目的基因的主要生物學(xué)功能標(biāo)準(zhǔn)，這也是現(xiàn)階段RNAi應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因功能研究的一個(gè)重要問(wèn)題；而且目前針對(duì)單基因的研究較多，而RNAi應(yīng)用于系統(tǒng)研究多基因功能的報(bào)道較少見(jiàn)，而肝癌的發(fā)生是多因素、多基因共同作用的結(jié)果，開展多基因功能篩選、以細(xì)胞通路為研究對(duì)象是以后的發(fā)展趨勢(shì)。

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