定心藤總黃酮的提取及抗氧化活性的研究

黃 瓊，田玉紅，蒲 香

（廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545006）

定心藤M(fèi)appianthus iodoies為茶茱萸科定心藤屬M(fèi)appianthus植物，木質(zhì)藤本，核果橢圓形，果肉薄而甜，為廣西瑤醫(yī)常用藥材“十八鉆”之一［1］，其根或老藤有祛風(fēng)活絡(luò)，除濕消腫和消炎的功效，臨床可用于毒蛇咬傷及黃疸的治療［2］，定心藤中主要含有黃酮，有機(jī)酸，生物堿，萜類，甾醇，鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分，黃酮類物質(zhì)具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗炎、抗病毒、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)等功效［3］。有關(guān)植物定心藤的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道［1-2，4-5］，但利用微波輔助提取定心藤中的黃酮及其抗氧化活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察了微波法從定心藤中提取黃酮類化合物影響的主要因素，研究了提取工藝條件，并通過(guò)DPPH·法初步探討了定心藤總黃酮的抗氧化活性，旨在為定心藤進(jìn)一步研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器 定心藤 (購(gòu)于廣西柳州藥材市場(chǎng))，粉碎后過(guò)十目篩得定心藤細(xì)粉；蘆丁對(duì)照品購(gòu)于上海市友思生物技術(shù)公司；1，1-二苯基苦基苯肼 (1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)購(gòu)于日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉；以上化學(xué)試劑均為分析純；紫外分光光度計(jì) (UV2000型)，上海分析儀器總廠；微波爐(WG800SL23-K6)，廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 定心藤總黃酮供試液的制備 稱取一定量的定心藤粉末，加入一定量的乙醇溶液微波輔助提取一定時(shí)間，得總黃酮提取液，待測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在相同條件下提取3個(gè)平行樣。

1.2.2 總黃酮測(cè)定方法［6］吸取一定量的黃酮提取液于50 mL比色管中，加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻、放置6 min后，加入1.0 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻、放置6 min后，加入10 mL 10%的NaOH溶液，加蒸餾水定容至25 mL。放置15 min后，以試劑為空白，于510 nm處測(cè)定吸光度A值。從工作曲線方程中計(jì)算出總黃酮含有量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按前述方法，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液的吸光度，得到蘆丁溶液質(zhì)量濃度 (mg/mL)與吸光度值關(guān)系曲線。

1.2.4 定心藤中總黃酮提取的工藝設(shè)計(jì) 選擇提取時(shí)間、含乙醇量、提取溫度、固液比4個(gè)因素為考察因素，選用L9(34)正交表對(duì)樣品中總黃酮提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定方法［7-9］將最佳工藝條件下提取的定心藤提取液干燥后，以無(wú)水乙醇為溶劑，配制成一定濃度的溶液。準(zhǔn)確稱量DPPH固體，并將其配制成質(zhì)量濃度20 mg/mL溶液，避光保存。在10.0 mL的具塞刻度試管中依次加入2 mL DPPH溶液，再加入一定量的不同體積的靈香草提取物溶液，以無(wú)水乙醇補(bǔ)加至4.0 mL刻度，充分混合均勻。同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在517 nm處測(cè)定不同質(zhì)量濃度的定心藤提取物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度，為能更好的反映變化趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)選擇的質(zhì)量濃度按照雙倍稀釋法來(lái)定。

定義定心藤提取物抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除率為［9-10］:

式中:Ai=2 mL DPPH溶液+各個(gè)質(zhì)量濃度定心藤提取物的吸光度 (樣品對(duì)DPPH·作用后的吸光度數(shù)值)；Aj=各個(gè)濃度定心藤提取物溶液在體系中未加DPPH溶液時(shí)的本底吸光度 (反映樣品自身對(duì)吸光度的貢獻(xiàn))；Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度 (為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 由前述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，質(zhì)量濃度C與吸光度A作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸運(yùn)算，得回歸方程:C=0.0949A+0.001；r=0.9996，線性范圍 8.48～43.2 μg/mL。

2.2 定心藤總黃酮提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

從表1正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果可知，因素對(duì)提取率 影響程度從強(qiáng)到弱依次是:固液比、微波作用功率、微波作用時(shí)間、含乙醇量。由K值可以判斷最佳工藝條件為A2B3C2D3，即微波功率處于中高火、含乙醇量65%、微波作用時(shí)間2 min、固液比1∶40。

最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):按最優(yōu)方案提取定心藤總黃酮，得總黃酮提取率為23.017%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)及單因素中的任何一組實(shí)驗(yàn)，因此可以確認(rèn)該方案為最優(yōu)。

2.3 對(duì)羥基自由基的清除作用 按照實(shí)驗(yàn)方法，將所得的結(jié)果吸光度值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求得清除率后作圖，圖1顯示了定心藤提取物對(duì)DPPH清除率與時(shí)間、濃度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)定心藤提取物對(duì)DPPH的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，50 min后各濃度對(duì)其清除率基本穩(wěn)定不變。

圖1 定心藤總黃酮對(duì)DPPH的清除能力

根據(jù)圖1顯示結(jié)果檢測(cè)不同質(zhì)量濃度定心藤提取物60 min時(shí)對(duì)DPPH的清除率，將所得的結(jié)果吸光度值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理求得清除率后與質(zhì)量濃度作圖得圖2。

圖2 定心藤總黃酮不同質(zhì)量濃度對(duì)DPPH清除能力的關(guān)系

由圖2可知，定心藤總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率在60 min時(shí)清除率與質(zhì)量濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系，線性擬合程度良好。

定義IC50為當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)抗氧化劑樣品的濃度，則由擬合對(duì)數(shù)曲線公式y(tǒng)=9.8845ln(x)+122.33(R=0.9944)，計(jì)算得定心藤總黃酮IC50為6.63×10－4mg/mL。對(duì)比合成抗氧化劑特丁基對(duì)苯二酚 (TBHQ)、丁基羥基茴香醚 (BHA)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 定心藤總黃酮與其他合成抗氧化劑比較分析

IC50越小，說(shuō)明其抗氧化活性越強(qiáng)。由表2可知，抗氧化性能強(qiáng)弱順序如下:

TBHQ＞定心藤總黃酮＞BHA，定心藤總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性能。

3 結(jié)論

近年來(lái)，大量的體內(nèi)和體外研究表明黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的活性，同時(shí)還具有抑菌、抗衰老、抗心肌缺血、降血脂、降血壓等藥理保健功能且毒副作用很小，是一類極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑［11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)確定了微波輔助提取定心藤總黃酮的最佳工藝條件，即微波功率處于中高火、含乙醇量65%、微波作用時(shí)間2 min、固液比1:40，在此條件下總黃酮提取率為23.017%，提取率略高于柯永建等［4］用超聲波提取的提取率 (17.7%)，而比曾立等［5］用乙醇回流提取高出許多，且用時(shí)短，說(shuō)明微波輔助提取定心藤總黃酮方便、快捷、提取率高，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)考察對(duì)DPPH·自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)定心藤總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性能，優(yōu)于合成抗氧化劑BHA，可為開(kāi)發(fā)一種新型的天然抗氧化劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為定心藤進(jìn)一步研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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