細(xì)莖石斛中抗氧化的有效成分研究

王玨 王鐵杰 殷果 王淑紅 魯藝 李曉帆

細(xì)莖石斛 Dendrobium moniliforme(Linn.).sw.為蘭科石仙桃屬植物，分布于我國的四川、湖南、廣西等地。其全草或假鱗莖可以入藥，具有清熱利濕、散風(fēng)止痛之功效，在民間用于治療消化不良、癰瘡腫毒及風(fēng)濕疼痛等疾?。?］。目前從石仙桃中分離得到的主要為三萜類成分［2］。在初步的活性篩選過程中，細(xì)莖石斛全草60%乙醇提取物顯示了出較好的抑制脂多糖(LPS)和干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的大鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)一氧化氮(NO)生成的活性，即在終濃度為30μg/ml時(shí)抑制率為78.9%，且無細(xì)胞毒作用。因此筆者對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從細(xì)莖石斛干燥全草60%乙醇提取物中分離得到了6個(gè)化合物，根據(jù)理化常數(shù)和光譜分析鑒定其結(jié)構(gòu)，分別為分別為 4，4’-二羥基-3，3’，5-三甲氧基-，’-二羰基二苯乙烯(1)，4，4'-二羥基-3，3'，5，α'-四甲氧基二苯乙烯(2)，4，4'，α'-三羥基-3，3'，5-三甲氧基二苯乙烯(3)，反式-3，5-二羥基-5-甲氧基二苯乙烯(4)，3，7-二羥基-2，4-二甲氧基菲(5)，毛蘭菲(6)，化合物1首次從該植物中分離得有效活性成分。利用體外測(cè)定大鼠巨噬細(xì)胞NO生成量的活性篩選方法測(cè)定了6化合物的活性，其中化合物2和3具有很好的抑制大鼠巨噬細(xì)胞NO生成的作用，化合物3，5和6有強(qiáng)于白藜蘆醇和蘆丁的DPPH自由基捕捉削去作用。

1 儀器與材料

紫外光譜用島津UV2401PC型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定(甲醇);紅外光譜用島津FT/IR-8400型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定(KBr);HR-ESI-MS和ESI-MS分別用Micromass Q-TOF型和Bruker Esquire 2000型質(zhì)譜儀測(cè)定;核磁共振光譜用Bruker Avance 400型核磁共振波譜儀測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)。薄層層析用硅膠G和色譜用硅膠(200-300目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)。

2 提取與分離

細(xì)莖石斛全草2.3kg，60%乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，減壓回收乙醇得浸膏(270 g，11.7%)。將浸膏用水(3.0 L)分散，依次用石油醚(3.0 L×3)、乙酸乙酯(3.0 L×3)和正丁醇(3.0 L×3)進(jìn)行萃取。石油醚部分(45.0 g)經(jīng)過硅膠柱色譜，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到13個(gè)部份。Fr.10(10 g)經(jīng) Sephadex LH-20 柱色譜，甲醇-水(60∶40)為洗脫劑，然后經(jīng)ODS中低壓柱色譜，以甲醇-水(50∶50，70∶70)洗脫，再經(jīng)制備 HPLC［甲醇-水(47∶53)，10 ml/min，275 nm］純化得到化合物 4(11.4 mg)，2(50.6 mg)和6(14.4 mg)。Fr.7-4 經(jīng) ODS 柱色譜，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脫，再經(jīng)制備 HPLC［甲醇-水(38∶62)，10 ml/min，220 nm］純化得到化合物5(17.4 mg);Fr.7-5經(jīng)ODS柱色譜，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脫，再經(jīng)制備 HPLC［甲醇-水(42∶58)，10 ml/min，220 nm］純化得到化合物1(6.8 mg)，3(5.8 mg)。

3 抑制大鼠巨噬細(xì)胞NO生成的活性測(cè)試

取大鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系(RAW 264.7)細(xì)胞，以1.2×106個(gè)/ml的濃度，每孔 200μL接種在 96孔板(SumitomoBakelite，#8096R，Tokyo)中，在 37°C 下培養(yǎng) 2 h。然后將0.4 μl供試品(終濃度:3 μM，10μM，30μM，100μM)與 2 μL LPS(終濃度:100ng/ml)和2 μL INF-γ(終濃度:0.33 ng/ml)一同加入到細(xì)胞液中，共同在37°C下培養(yǎng)16 h，之后將細(xì)胞液迅速冷卻。取上清液按照每孔100μL置于新的96孔板中，接著在每孔中加入50μL的Griess試劑。室溫下放置10 min后，用酶標(biāo)儀在550nm測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸收值，并扣除在630nm測(cè)定的背景吸收值。在同一塊96孔板中，同時(shí)加入NaNOa的標(biāo)準(zhǔn)溶液用以計(jì)算NO-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以未加細(xì)胞、LPS、INF-γ和供試品的細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白，以未加樣品的細(xì)胞液作為陰性對(duì)照，以白藜蘆醇(resveratrol)作為陽性對(duì)照。用MTT法測(cè)試細(xì)胞毒作用。NO抑制率=［(A陰性對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A陰性對(duì)照組)］×100%。(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1)

表1 化合物體外抑制大鼠巨噬細(xì)胞NO生成的試驗(yàn)及DPPH自由基清除作用結(jié)果

4 DPPH自由基清除作用測(cè)試

參照文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法并加以改進(jìn)，將不同濃度的供試品溶液100μL和2×10-4M DPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同時(shí)以不加DPPH·的供試品溶液各濃度作為對(duì)照以消除供試品本身顏色對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH·陰性對(duì)照(以100μL無水乙醇代替供試品)，每組平行設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，震蕩1 min，并于此條件下保存(室溫、避光)，30 min后測(cè)試其在517 nm處的吸光度OD值，按如下公式計(jì)算供試品的自由基清除率。自由基清除率=［ODDPPH·陰性對(duì)照組-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD實(shí)驗(yàn)組乙醇對(duì)值)］/ODDPPH·陰性對(duì)照組×100%(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1)

5 結(jié)論

隨著對(duì)自由基研究的逐漸深入，人們認(rèn)識(shí)到自由基與衰老、癌癥、心腦血管疾病和炎癥等的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)一氧化氮(NO)和DPPH都是自由基及抗氧化活性的常用試劑。NO及DPPH參與許多生理和病理過程，巨噬細(xì)胞在IL-1、IL-2、TNF、IFN等細(xì)胞因子和內(nèi)毒素(如LPS)的誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生大量的NO，同時(shí)NO上調(diào)又可以使巨噬細(xì)胞釋放炎癥性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-la和rIFN等。這些因子對(duì)機(jī)體既起到介導(dǎo)炎癥的作用，又起到細(xì)胞生長分化的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境變化時(shí)可通過NO產(chǎn)生免疫保護(hù)、免疫損傷和免疫調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)利用體外抑制大鼠巨噬細(xì)胞NO生成的活性測(cè)試體系，對(duì)從細(xì)莖石斛中分離得到的6個(gè)化合物進(jìn)行了活性測(cè)定，結(jié)果表明化合物1、2和3具有很好的NO生成的抑制作用，活性好、于陽性對(duì)照白藜蘆醇和蘆丁，并且沒有細(xì)胞毒作用。化合物3，5和6具有很好的DPPH自由基捕捉削去能力，化合物5和6活性結(jié)果好于陽性對(duì)照白藜蘆醇和蘆丁一倍左右。該結(jié)果提示細(xì)莖石斛中的抗炎抗氧化活性成分可能為芐類及其衍生化合物。

［1］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Chinese Materia Medica(中藥大詞典).Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers，1986.

［2］Ma X M，Li M F，Zhang Q R.Chemical constitutes of Yunnan Pholidota(Pholidota yunnnanesis).Zhongcaoyao(中草藥)，1995，26(2):59-61.