杏仁種皮黑色素提取工藝優(yōu)化

李巨秀，李紅姣，趙 忠,*，夏秋敏，朱海蘭

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

杏仁種皮黑色素提取工藝優(yōu)化

李巨秀1，李紅姣2，趙 忠2,*，夏秋敏1，朱海蘭2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以杏仁種皮為試驗(yàn)材料，采用堿溶解酸沉淀的方法提取黑色素，以氫氧化鈉溶液濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為考察因素，以黑色素得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，研究山杏種皮黑色素的提取工藝。結(jié)果表明：氫氧化鈉濃度、提取溫度、料液比3個(gè)因素對(duì)黑色素的得率均表現(xiàn)出極顯著(P＜0.01)影響；3個(gè)因素對(duì)黑色素提取得率影響的主次順序?yàn)樘崛囟龋練溲趸c濃度＞料液比；最佳工藝為氫氧化鈉濃度0.4mol/L、提取溫度80℃、提取時(shí)間6h、料液比1:20(g/mL)，黑色素得率達(dá)到7.2%。

杏仁種皮；黑色素；提取工藝

黑色素是多酚或吲哚的復(fù)雜聚合物，具有抗紫外線輻射、螯合金屬離子、促進(jìn)免疫和抗氧化活性等功能作用[1-3]。已有研究表明，從黑香種草(Nigella sativa L.)中提取的黑色素可治療與細(xì)胞因子產(chǎn)生不平衡相關(guān)的一些疾??；茶葉黑色素可以保護(hù)由聯(lián)氨誘導(dǎo)的肝臟損失，并且黑色素可以在天然產(chǎn)品中用于防治自由基氧化反應(yīng)[4-6]。黑色素根據(jù)其組成可分為3類：真黑素(eumelanins)、棕黑素(phaeomelanins)和異黑素(allomelanins)。真黑色素是一種深黑色的顏色，含有氮元素，而棕黑素是黃色-微紅色-褐色，含有硫元素的色素[7-8]。已有研究人員對(duì)不同材料中黑色素的提取、性質(zhì)等方面做了大量研究，如黑米、烏骨雞、魷魚(yú)墨、烏飯樹(shù)葉等中的黑色素[9-13]。黑色素由于其獨(dú)特的功能特性，在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。目前，黑色素的市場(chǎng)主要以化學(xué)合成為主，而植物中的天然黑色素需要研究和開(kāi)發(fā)。杏仁種皮是杏仁產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物，大約占杏仁質(zhì)量的5%[14]。杏仁種皮中含有豐富的黑色素，但對(duì)杏仁黑色素的提取工藝參數(shù)和性質(zhì)研究報(bào)道較少。由于黑色素除了溶于堿溶液，微溶于二甲基亞砜外，幾乎不溶于其他任何常規(guī)試劑和有機(jī)溶劑[15-16]，因此利用堿溶酸沉淀是黑色素主要的提取方法。本實(shí)驗(yàn)擬利用氫氧化鈉溶液溶解、鹽酸溶液沉淀提取杏仁種皮中的黑色素，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化出杏仁黑色素的提取工藝，為該黑色素的理化性質(zhì)、功能特性和開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏仁種皮：將產(chǎn)自甘肅平?jīng)龅男尤适止とテ?，種皮在自然條件下風(fēng)干后備用；氫氧化鈉、丙酮、乙酸乙酯 天津市博迪化工有限公司；鹽酸 成都市科龍化工試劑廠；無(wú)水乙醇 西安三浦化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DSY-1-4型電熱恒溫水浴鍋 北京愛(ài)琦霞商貿(mào)有限公司；AG135型分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SC-3610型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏仁種皮黑色素提取工藝流程

采用堿溶酸沉淀法提取杏仁種皮黑色素的工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 杏仁種皮黑色素的提取工藝Fig.1 Flow chart for melanin extraction from apricot kernel skin

1.3.2 杏仁種皮黑色素提取的單因素試驗(yàn)

以黑色素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)氫氧化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的影響效果和適宜范圍。

1.3.2.1 氫氧化鈉濃度對(duì)黑色素得率的影響

稱取5份10.00g杏仁種皮于500mL燒杯中，加入200mL蒸餾水，煮沸5min，用紗布過(guò)濾后將濾渣轉(zhuǎn)移至燒杯中，以0.00、0.25、0.50、0.75、1.00mol/L NaOH溶液作為提取劑，料液比1:15(g/mL)，燒杯用保鮮膜封口后置于60℃水浴中提取2h。計(jì)算黑色素的得率，以確定適宜的氫氧化鈉濃度。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響

以0.50mol/L NaOH溶液作為杏仁種皮提取劑，其余條件同1.3.2.1節(jié)，研究水浴2、4、5、6、8h對(duì)黑色素得率的影響，以確定適宜的提取時(shí)間。

1.3.2.3 提取溫度的選擇

水浴6h，其余條件同1.3.2.2節(jié)，研究水浴溫度20、40、60、80、100℃對(duì)黑色素得率的影響，以確定適宜的提取溫度。

1.3.2.4 料液比對(duì)黑色素得率的影響

水浴溫度100℃，其余條件同1.3.2.3節(jié)，研究料液比1:6、1:10、1:15、1:20、1:25對(duì)黑色素得率的影響，以確定適宜的料液比。

1.3.3 杏仁種皮黑色素提取的優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以氫氧化鈉濃度、提取溫度、提取料液比為考察因素，提取時(shí)間6h，以黑色素得率為指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，從中篩選最優(yōu)的工藝條件和技術(shù)參數(shù)。因素水平見(jiàn)表1。所有組合均進(jìn)行兩次重復(fù)試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels of the factors tested in orthogonal array design

1.3.4 黑色素得率計(jì)算

按照下列公式計(jì)算黑色素得率。

式中：X為黑色素得率/%；m1為真空干燥后的黑色素質(zhì)量/g；m為稱取的杏仁種皮質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用DPS7.55統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫氧化鈉濃度對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響

圖2 氫氧化鈉濃度對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the yield of melanin

在生物體內(nèi)，黑色素一般與蛋白質(zhì)、糖類等其他成分結(jié)合在一起，提取黑色素需先破壞化學(xué)鍵。由于黑色素一般溶于堿性溶液和微溶于二甲基亞砜，所以試驗(yàn)中通常采用氨水或NaOH溶液等堿溶液作為提取溶劑，但氨水易揮發(fā)，而且揮發(fā)氣體具有刺激性，因此本試驗(yàn)以不同濃度的NaOH溶液為提取溶劑進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，NaOH濃度對(duì)杏仁種皮黑色素得率有顯著影響，蒸餾水幾乎提取不出黑色素，隨著氫氧化鈉濃度的增大，黑色素的得率也不斷增大，當(dāng)濃度增大到0.50mol/L時(shí)取得最大值，此后黑色素得率隨著氫氧化鈉濃度的增大而減小，由此可知提取杏仁種皮黑色素的NaOH適宜濃度為0.50mol/L。

2.2 提取時(shí)間對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響

黑色素為非均勻性的無(wú)定形大分子物質(zhì)，具有不溶于水和常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，且一般與蛋白質(zhì)或糖類牢固地結(jié)合在一起等特殊的性質(zhì)，因而氫氧化鈉深入到植物組織中充分溶解黑色素需要一定的時(shí)間。提取時(shí)間對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on the yield of melanin

由圖3可知，在提取時(shí)間1～6h范圍內(nèi)，黑色素提取得率不斷增大，但6h之后提取得率幾乎不變，綜合考慮黑色素提取得率和成本，以6h作為進(jìn)一步試驗(yàn)的提取時(shí)間。

2.3 提取溫度對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響

一般來(lái)說(shuō)，溫度越高，擴(kuò)散速度越快，被提取的目標(biāo)組分的得率就越高。因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)加快，使得植物組織軟化變快，促進(jìn)了膨脹，從而增加可溶性物質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散速度，促進(jìn)有效成分浸出。因此溫度對(duì)于黑色素的提取是一個(gè)重要的因素，不同提取溫度對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著溫度升高黑色素的提取得率不斷增大，室溫下黑色素的得率很低。植物黑色素是一類由酚類聚合而成的大分子物質(zhì)，易于被氧化，在溫度高于60℃后，可能會(huì)造成一部分黑色素被氧化，前人研究表明，在氧化過(guò)程中，酚羥基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)轷?。因此本試?yàn)中對(duì)黑色素進(jìn)行了充氮保護(hù)。溫度過(guò)高一方面會(huì)增大氧化程度，另一方面消耗的熱量過(guò)多，不利于工業(yè)化提取，所以將100℃作為杏仁黑色素的提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of melanin

2.4 料液比對(duì)杏仁種皮黑色素得率的影響

濃度差是溶劑提取過(guò)程的一個(gè)推動(dòng)力。在提取過(guò)程中，保持良好的濃度差，將得到良好的浸提效果。一般情況下，用的溶劑越多，浸取出來(lái)的物質(zhì)就越多，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，再增加溶劑量也不能使浸出物質(zhì)有所增加。因此選擇適宜的料液比也是對(duì)原料和溶劑的最大化利用，不同料液比對(duì)黑色素得率的影響如圖5所示。

圖5 不同料液比對(duì)黑色素得率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of melanin

由圖5可知，料液比對(duì)杏仁種皮黑色素的得率有較為顯著的影響。在料液比(g/mL)1:6～1:20范圍內(nèi)，黑色素得率隨料液比的增加而逐步增大，當(dāng)增加到1:20時(shí)黑色素的得率達(dá)到最大值，當(dāng)料液比再增大，黑色素的得率趨于下降，因此，選擇1:20作為進(jìn)一步試驗(yàn)的提取料液比。

2.5 杏仁種皮黑色素提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，對(duì)影響山杏種皮黑色素得率的因素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 杏仁種皮黑色素提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results for optimizing the extraction of melanin from apricot kernel skin

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

由表2可知，3個(gè)因素對(duì)黑色素提取得率影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即提取溫度＞氫氧化鈉濃度＞料液比。試驗(yàn)所得最佳優(yōu)化工藝組合為A1B2C2，即氫氧化鈉濃度4.0mol/L、提取溫度80℃、料液比1:20。由表3可知，氫氧化鈉濃度、提取溫度、料液比3個(gè)因素對(duì)黑色素的得率均表現(xiàn)出極顯著(P＜0.01)影響。

3 結(jié) 論

采用堿溶酸沉淀法提取杏仁種皮中黑色素的優(yōu)化工藝為氫氧化鈉濃度0.40mol/L、提取溫度80℃、料液比1:20、提取時(shí)間6h，黑色素得率達(dá)7%以上，且氫氧化鈉濃度、提取溫度和料液比3個(gè)因素對(duì)黑色素的得率均表現(xiàn)出極顯著(P＜0.01)影響，三者對(duì)黑色素得率影響的主次順序?yàn)樘崛囟龋練溲趸c濃度＞料液比。該工藝操作簡(jiǎn)單，提取效率較高。

[1] 徐磊, 錢振明, 孫繼波, 等. 短梗霉黑色素的分離純化及結(jié)構(gòu)的初步分析[J]. 氨基酸和生物資源, 2009, 31(2): 9-13.

[2] 涂勇羽, 孫亞真, 田穎剛, 等. 泰和烏骨雞黑色素的體外抗氧化作用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(2): 145-149.

[3] SAVA V M, GALKIN B N, HONG M Y, et al. A Novel melanin-like pigment derived from black tea leaves with immuno-stimulating activeity[J]. Food Rresearch Intetnational, 2001, 34(4): 337-343.

[4] SAVA V M, HUNG Y C, BLAGODARSKY V A, et al. The liverprotecting activity of melanin-like ppigment derived from black tea[J].Food Research International, 2003, 36(5): 505-511.

[5] HUNG Y C, SAVA V M, BLAGODARSKY V A, et al. Protection of tea melanin on hydrazine-induced liver injury[J]. Life Sciences, 2003, 72(9): 1061-1071.

[6] HUNG Y C, SAVA V M, MAKAN S Y, et al. Antioxidant activity of melanins derived from tea: comparison between different oxidative states[J]. Food Chemistry, 2002, 78(2): 233-240.

[7] CAPOZZI V, PEMA G, CARMONE P, et al. Optical and photoelectronic properties of melanin [J]. Thin Solid Films, 2006, 511-512(3):362-366.

[8] BARBARA B. Progress of infrared investigations of melanin structures[J]. Spectrochimica Acta Part A, 1996, 52(9): 1157-1162.

[9] 張吉祥, 趙文靜, 白曉杰, 等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)化黑米黑色素的超聲輔助提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 39-42.

[10] 李欣, 田穎剛, 謝明勇, 等. 烏骨雞黑色素的提取分離及抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18): 117-121.

[11] 宋茹, 李厚寶, 鄧尚貴. 魷魚(yú)墨黑色素酶解法提取工藝優(yōu)化及其紫外、紅外光譜特征分析[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(18): 63-67.

[12] 胡志杰, 蔡智慧. 微波輻射提取烏飯樹(shù)葉黑色素工藝的研究[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2007, 26(6): 52-57.

[13] 陸懋蓀, 尹佩玉, 容蓉, 等. 黑芝麻黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(11): 91-94.

[14] 姚增玉, 趙忠, 史清華, 等. 山杏種皮黑色素提取工藝研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 35(5): 120-126.

[15] 葉明, 朱立, 楊柳, 等. Plectania YM421胞內(nèi)黑色素提取及其生物功能[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(2): 229-233.

[16] 徐磊. 短梗霉黑色素的分離提取及其結(jié)構(gòu)分析[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2006.

Optimization of Extraction Process for Melanin Pigment from Apricot Kernel Skin

LI Ju-xiu1，LI Hong-jiao2，ZHAO Zhong2,*，XIA Qiu-min1，ZHU Hai-lan2
(1. College of Food Technology and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Melanin is a kind of complex polymeric phenolic compound, which can be used in the field of medicine, cosmetics,food and electron. In this work, melanin was extracted from apricot kernel skin by alkaline extraction, acid hydrolysis, and repeated precipitation, and one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize four extraction conditions including NaOH concentration, extraction temperature, extraction time and material-to-liquid ratio based on melanin yield. Three extraction conditions except extraction time had a highly significant effect on melanin yield (P ＜ 0.01), and could be ranked in descending order of importance as follows: extraction temperature ＞ NaOH concentration ＞ material-to-liquid ratio. The optimal extraction conditions were NaOH concentration of 0.4 mol/L, extraction temperature of 80 ℃, and extraction duration of 6 h, and material-to-liquid ratio of 1:20. Under these conditions, the yield of melanin was 7.2%.

apricot kernel skin；melanin；extraction process

S662.209.9

A

1002-6630(2012)08-0011-04

2011-01-27

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性科研專項(xiàng)(200904020)

李巨秀(1972—)，女，副教授，博士，主要從事食品化學(xué)和功能食品的研究。E-mail：lijuxiu@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：趙忠(1958一)，男，教授，博士，主要從事森林培育研究。E-mail：zhaozh@nwsuaf.edu.cn