麝香保心丸對心力衰竭大鼠腎臟血管緊張素Ⅱ受體各亞型表達(dá)的影響

劉 飛 李艷芳* 曹芳芳 張玲姬 白雪源 呂 楊

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100029;2.解放軍總醫(yī)院腎科，北京 100039)

心力衰竭時(shí)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(reninangiotensin aldosterone system，RAAS)被激活，其對腎臟的調(diào)節(jié)作用主要通過ATR來實(shí)現(xiàn)。ATR各亞型在腎臟均有表達(dá)，對調(diào)節(jié)腎臟血流灌注、水鹽平衡和細(xì)胞增生等都有著重要作用。中醫(yī)中藥對心力衰竭的治療有著重要作用。目前，有關(guān)中藥對心力衰竭時(shí)腎臟ATR各亞型表達(dá)影響的報(bào)道較少，為此，本文對其進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)近交系雄性Wistar大鼠，10周齡，質(zhì)量250～280g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。動(dòng)物房溫度維持在(22±3)℃，相對濕度為(50% ±20%)。80只雄性Wistar大鼠，采用抽簽法隨機(jī)分為正常對照組(A組，10只，0.9%的氯化鈉注射液2mL灌胃)、假手術(shù)組(B組，10只，0.9%的氯化鈉注射液2mL灌胃)，其余60只制作心肌梗死后心力衰竭模型，術(shù)后死亡25只，35只大鼠模型制作成功，采用抽簽法隨機(jī)分為模型組(C組，9只，0.9%氯化鈉注射液2mL灌胃)、陽性藥物對照組(D組，8只，消心痛按1mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化鈉注射液灌胃，)、麝香保心丸小劑量組(E組，9只，麝香保心丸按22.5 mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化鈉注射液灌胃)，麝香保心丸大劑量組(F組，9只，麝香保心丸按45 mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化鈉注射液灌胃)。每組均為2次/日灌胃，持續(xù)8周。之后將以上6組大鼠以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，行腹正中切口取腎臟，剔除外周結(jié)締組織，取皮質(zhì)，立即置于－80℃冰箱保存待測。

注:麝香保心丸的給藥劑量按動(dòng)物與人體表面積換算成等效劑量，22.5 mg/kg為小劑量，45 mg/kg為大劑量。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

麝香保心丸(微粒丸22.5mg):上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)080704。TRIzol購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、dNTP及PCR試劑購自TaKaRa Biotechnology生物工程大連有限公司，PCR引物由北京賽百盛公司合成。

1.3 心肌梗死后心力衰竭模型制作

大鼠稱體質(zhì)量后以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，備皮，仰臥固定，行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率80/min，吸呼比1∶1)，監(jiān)測心電圖。常規(guī)強(qiáng)力碘消毒，于胸骨左側(cè)第4肋間開一橫切口暴露心臟，由左心耳下方2～3mm結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎即刻心電監(jiān)護(hù)顯示肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF和V3導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高＞0.2mV，并呈動(dòng)態(tài)演變過程，1周時(shí)復(fù)查心電圖見病理性Q波為心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后超聲心動(dòng)圖檢測顯示，左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%為心力衰竭模型制作成功的標(biāo)志。假手術(shù)組只栓線，不結(jié)扎。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測心功能

檢測前以1%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥固定。探頭置于胸前，探頭頻率10MHz，圖像深度2.5cm。取胸骨旁左心室長軸及短軸切面進(jìn)行測量，測量參數(shù)包括左心室舒張末內(nèi)徑(left ventricle end diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricle end systolic dimension，LVESD)和LVEF，每項(xiàng)指標(biāo)均測量3個(gè)心動(dòng)周期，結(jié)果取平均值。

1.5 RT-PCR檢測

采用RT-PCR法檢測腎皮質(zhì)AT1R和AT2R的mRNA表達(dá)水平。方法:①提取總RNA:用TRIzol總RNA試劑盒提取大鼠腎臟皮質(zhì)的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的濃度，計(jì)算樣品總RNA濃度。②反轉(zhuǎn)錄:取模板RNA 5μg，加入 DEPC 處理水補(bǔ)至10μL，置于80℃水浴中變性5 min，迅速冰浴。依次加入5×buffer 5μL，20mmol/L dNTPs 2μL，0.1mol/L DTT 1μL，RNA 酶抑制劑0.5μL，Oligo-dT 0.5μL，M-MLV 1μL，補(bǔ)DEPC處理水至25μL?；靹颍糜?7℃水浴孵育1.5 h，得25μL cDNA放置于－20℃冰箱中。③聚合酶鏈反應(yīng):取1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，依次加入10×緩沖液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物，并加去離子水補(bǔ)至25 μL，混勻。選用管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。各指標(biāo)引物序列與反應(yīng)參數(shù)如下:GAPDH引物序列為:上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 變性 45s，58℃ 退火45s，72℃延伸45s(30個(gè)循環(huán))。AT1R引物序列為:上游引物5'-CGTCATCCATGACTGTAAAATTTC-3'，下游引物5'-GGGCATTACATTGCCAGTGTG-3'，反應(yīng)參數(shù)為:94℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s(30 個(gè)循環(huán))。AT2R引物序列為:上游引物5'-GTGTGGGCCTCCAAACCATTGCTA-3'，下游引物 5'-TTGCTGCCACCAGCAGAAAG-3'，反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 變性 45s，53℃ 退火45s，72℃延伸45s(33個(gè)循環(huán))。④擴(kuò)增的AT1R、AT2R片段長度分別為306和445個(gè)堿基對。取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離，Alpha imager 2200(NatureGene Corporation，USA)照相。應(yīng)用光密度分析測定mRNA的水平。用Quantity one軟件對圖像進(jìn)行吸光度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶信號(hào)強(qiáng)度的比值代表組織中目的受體的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各亞型mRNA表達(dá)水平的比較

B組的AT1R、AT2R與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與B組比較，C組大鼠AT1R表達(dá)明顯上調(diào)，AT2R表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與C組比較，D、E、F組大鼠AT1R表達(dá)明顯下調(diào)，AT2R表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與E組比較，F(xiàn)組大鼠AT1R表達(dá)下調(diào)更顯著(P ＜0.05)(圖1，表1)。

圖1 各組大鼠AT1R和AT2R mRNA表達(dá)水平Fig.1 Level of AT1R and AT2R mRNA expression in each group.

表1 各組大鼠AT1R和AT2R mRNA表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of AT1R and AT2R mRNA expression in each group (±s)

表1 各組大鼠AT1R和AT2R mRNA表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of AT1R and AT2R mRNA expression in each group (±s)

*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs group B;△P＜0.05;△△P＜0.01 vs group C;▲P＜0.05 vs group E;A:control group;B:shame group;C:model group;D:medicine control group;E:small dose of Shexiangbaoxin pills;F:large dose of sh xiangbaoxin pills;ATR:angiotensin Ⅱ receptor.

Group Number of case AT1R AT2R A 10 0.48±0.05 0.88±0.05 B 10 0.47±0.08 0.85±0.04 C 9 0.55±0.06* 0.64±0.06＊＊D 8 0.47 ±0.04△△ 0.80 ±0.05△△E 90.49±0.04△ 0.76±0.04△△F 9 0.44 ±0.05△△▲ 0.77 ±0.05△△

3 討論

麝香保心丸由麝香、人參提取物、牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片等七味藥物組成。其中，麝香有擴(kuò)張血管、強(qiáng)心的作用;蘇合香、冰片可減慢心率、增加冠狀動(dòng)脈血流;蟾酥、牛黃可增加心肌收縮力;人參提取物具有抗氧化和減慢心率的功效［1］，上述研究結(jié)果為麝香保心丸治療心力衰竭提供了可靠的理論基礎(chǔ)。近年來研究［2-3］表明，長期應(yīng)用麝香保心丸可以降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)心絞痛的發(fā)生率，改善心肌梗死的預(yù)后，促進(jìn)心功能的恢復(fù)。麝香保心丸的組方遵循“君臣佐使”的中醫(yī)藥原則，其中，君藥為麝香;臣藥含人參提取物和蘇合香;佐藥含牛黃、肉桂和蟾酥;使藥為冰片。此為不同藥性的藥物搭配使用，增強(qiáng)療效而減少不良反應(yīng)。例如，冰片為寒性藥物，但加入肉桂等溫性藥物后，冰片的擴(kuò)血管作用得到保留且對胃腸道的刺激減少;麝香和冰片搭配，既保留了改善缺血的作用又減少了冰片的使用劑量。

ATR在腎臟中廣泛分布，其中以血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)最為顯著。AT1R是介導(dǎo)腎臟功能調(diào)節(jié)的主要亞型，其表達(dá)量在腎臟占90%以上，與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)結(jié)合后可使血管收縮、細(xì)胞增生纖維化，并促進(jìn)腎小管對水鈉的重吸收。AT2R表達(dá)量在腎臟占5% ～10%，其功能與AT1R相拮抗［4-5］，激動(dòng)后可產(chǎn)生使血管舒張、抑制細(xì)胞增生、促進(jìn)水鹽排泄的作用，是腎臟的保護(hù)性受體。

心力衰竭的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)有眾多神經(jīng)體液因素參與并共同調(diào)節(jié)的過程，其中RAAS被激活是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，其對腎臟的調(diào)節(jié)作用主要通過ATR來實(shí)現(xiàn)。本研究中，心力衰竭大鼠腎臟AT1R的表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，AT2R的表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，與Clayton S C等［6］報(bào)道的心力衰竭時(shí)兔腎臟ATR表達(dá)水平改變的結(jié)果相一致。國外有研究［7-8］表明，高濃度的AngⅡ通過激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)AT1R的表達(dá)，提示在AT1R與AngⅡ的作用中存在正反饋調(diào)節(jié)，心力衰竭時(shí)腎臟AT1R表達(dá)水平上調(diào)可能與這種正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。Saito M等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，AT1R被激活后會(huì)下調(diào)AT2R的表達(dá)，表明AT2R的表達(dá)調(diào)控不僅受到RAAS激活的影響，還可能與AT1R和AT2R之間的交互作用有關(guān)。

本研究中，藥物治療8周后，與C組比較，D、E、F組大鼠AT1R表達(dá)明顯下調(diào)，究其原因可能與藥物治療后機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)異常得到改善、RAAS激活被抑制有關(guān)。RAAS被抑制后，血管緊張素Ⅱ受體相關(guān)蛋白(ATRAP)表達(dá)增加［10］，ATRAP可通過降低MAPK活性、促進(jìn)AT1R內(nèi)化起到抑制AT1R的作用［11-12］。與E組比較，F(xiàn)組大鼠 AT1R表達(dá)下調(diào)更顯著，表明大劑量麝香保心丸對RAAS抑制更強(qiáng)，治療作用更好。作為腎臟的保護(hù)性受體，與C組比較，D、E、F組大鼠AT2R表達(dá)明顯上調(diào)，提示在心力衰竭改善后，機(jī)體的代償能力得到恢復(fù)，有利于發(fā)揮其生理性保護(hù)作用。此外，AT2R表達(dá)上調(diào)還可能與AT1R 被抑制有關(guān)［9］。

心力衰竭時(shí)RAAS激活，AngⅡ濃度升高導(dǎo)致腎臟ATR各亞型表達(dá)改變，表現(xiàn)為AT1R上調(diào)和AT2R下調(diào)。本研究結(jié)果表明，通過麝香保心丸8周灌胃治療心力衰竭大鼠，調(diào)節(jié)了腎臟ATR各亞型的表達(dá)，使上調(diào)的AT1R出現(xiàn)下調(diào)，使下調(diào)的AT2R出現(xiàn)上調(diào)，對心力衰竭時(shí)激活的RAAS起到了有益的調(diào)節(jié)作用，保護(hù)了心力衰竭時(shí)受損的腎臟功能。本研究中，與小劑量麝香保心丸比較，大劑量麝香保心丸的治療作用更為顯著，可能與大劑量麝香保心丸對血管的擴(kuò)張作用進(jìn)一步增強(qiáng)，更有效地改善了血流動(dòng)力學(xué)有關(guān)。因此，推薦在心力衰竭的治療中使用大劑量麝香保心丸以保護(hù)腎功能。

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