遲發(fā)性阿爾茨海默病患者血清尿激酶型纖溶酶原激活因子濃度的測定及其意義

向紹通 徐書雯* 李東風(fēng)

(1.廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)神經(jīng)內(nèi)科廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所廣東省神經(jīng)科學(xué)研究所，廣州 510080;2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510080)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的老年異質(zhì)性腦神經(jīng)退行性疾病，以進行性記憶和認知功能喪失為主要臨床特征，是一種主要的老年癡呆癥，其病理特征以老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主。有文獻報道［1-2］，醫(yī)師如能在患者病理改變尚未達到不可逆階段時進行早期干預(yù)治療，可延緩或阻止病情發(fā)展，極大地減少AD對患者及社會的危害，故AD的早期診斷具有十分重要的意義。但到目前為止，還沒有獲得一個一致的、易重復(fù)的、敏感特異性均較高的理想生化標志物。β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的神經(jīng)毒作用是多種因素導(dǎo)致AD發(fā)病的共同通路，血清尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，可將無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶，后者可以降解聚集體或非聚集體形式的Aβ［3］，Alonso D F 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，血漿纖溶酶循環(huán)的異常與癡呆的嚴重程度相關(guān)，尚不知血清uPA濃度與AD的關(guān)系如何，是否可作為AD早期診斷的生物學(xué)標志。

1 資料和方法

1.1 研究對象與納入標準

納入標準與分型:①遲發(fā)型阿爾茨海默病(lateonset Alzheimer's disease，LOAD)患者:根據(jù)美國國立神經(jīng)病學(xué)、語言溝通障礙和卒中－老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會工作小組標準［5-6］中“很可能AD”的標準納入，簡易智能精神狀態(tài)量表評分:文盲≤17分、小學(xué)文化≤20分、初中以上文化≤24分，臨床癡呆評定量表≥1分，漢密頓抑郁量表評分＜7分，Hachinski缺血指數(shù)量表評分≤4分。患者為廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)2004年～2007年的門診及住院患者，均為漢族，遲發(fā)病例，相互間無血緣關(guān)系，共收集55例，男37例，女18例，年齡61～90歲，平均年齡(77.71±7.80)歲。根據(jù)臨床癡呆評定量表評分將患者分為輕度、中度和重度:1分為輕度，2分為中度，3分為重度。輕、中、重度癡呆例數(shù)分別為27、15、13例。②對照組:為廣東省人民醫(yī)院同期體檢人群中記憶及認知正常者，共61例，男43例，女18例，年齡66～86歲，平均年齡(75.63±5.10)歲，均為漢族，簡易智能精神狀態(tài)量表評分≥28分，漢密頓抑郁量表評分＜7;Hachinski缺血指數(shù)量表評分≤4分。年齡、性別均與LOAD組匹配。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

所有研究對象在獲得同意后，抽全血后制備成血清及提取白細胞后儲存于－70℃的冰箱。

1.2.2 血清uPA濃度測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測uPA濃度，試劑盒購自美國ASSAYPRO公司。血清樣本用EIA Diluent稀釋液按1∶2稀釋3倍;向微孔加入50 μL標準品或血清樣本，室溫孵育2 h;按說明書依次洗板后加入生物素?；痷PA抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶結(jié)合物、鉻精底物、中止液，最后用美國Bio-TEK公司的SvnergyTMHT多通道酶標儀于450 nm的波長讀取溶液的吸光度。所測濃度×3即為血清uPA濃度。

1.2.3 Plau基因P141L多態(tài)性基因分型［7］

所有入組病例均采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)進行plau基因P141L多態(tài)性基因分型，PCR引物:5'-CTGGTTGAGTCTTCCCTGAG-3'及5'-CTGCCACTTCTTCCTTCCCT-3'，引物由日本TaKaRa公司合成。擴增產(chǎn)物用AluⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切及電泳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SASV8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于病例組與對照組的年齡構(gòu)成和uPA濃度比較采用t檢驗，分層多組比較采用方差分析，對各組的性別構(gòu)成進行χ2一致性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增及酶切產(chǎn)物的檢測結(jié)果

基因型可根據(jù)等位基因的片段來判斷:C/C型(野生型)為 729 bp;C/T 型為729 bp，594 bp，135 bp;T/T 型為 594 bp，135 bp，詳見圖1。

圖1 Plau基因P141L多態(tài)位點PCR-RFLP電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP electrophoregram of P141L polymorphic of plau gene

2.2 臨床一般資料比較

LOAD組及對照組性別及年齡構(gòu)成，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，性別比較:χ2=0.14，P=0.708 3;年齡比較:t=1.70，P=0.092 5，詳見表1。

表1 LOAD組和對照組性別及年齡的比較Tab.1 Comparison of gender and age between LOAD group and control group

2.3 各組血清uPA濃度的比較

將LOAD組進一步分成輕度及中－重度兩組，與對照組進行血清uPA濃度的比較，數(shù)據(jù)顯示，中－重度LOAD組血清uPA濃度較輕度LOAD組及對照組血清uPA濃度低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.85，P=0.469 9)，詳見表2。

表2 LOAD組和對照組血清uPA濃度的比較Tab.2 Comparison of the concentration of uPA in serum between LOAD group and control group

2.4 Plau基因P141L多態(tài)性對血清uPA濃度的影響

將所有研究對象按基因型分為C/C、C/T、T/T 3組，3組血清uPA濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.89，P=0.009 2)，進一步進行兩兩比較分析，C/C組與C/T組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;C/C組與T/T組以及C/T組與T/T組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果表明，基因型C/C組及C/T組血清uPA濃度顯著高于T/T組，詳見表3。

表3 所有研究對象分C/C型、C/T型與T/T型3組血清uPA濃度的比較Tab.3 Comparison of the concentration of uPA in serum among the three genotypes from all subjects

3 討論

uPA是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，uPA與其特異受體相結(jié)合，可將無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶。纖溶酶uPA與Aβ的降解密切相關(guān):Ledesma M D等［8］研究表明，纖溶酶可以增加人β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid protein precursor，APP)在α切割位點上的裂解過程，從而有效地降低Aβ的分泌。也有體外研究顯示［9］，uPA可以抑制Aβ微纖維的形成，減少Aβ的沉積，從而降低Aβ的毒力。Davis J等［10］報道，Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌(human cerebro-vascular smooth muscle，HCSM)細胞中纖溶酶原激活因子的表達，利用核糖核酸酶保護測定和纖溶酶原酶譜分析法可以發(fā)現(xiàn)上述過程中纖溶酶原激活因子的表達主要是uPA，并伴隨uPAR表達的增加;在存在纖溶酶原的情況下，HCSM細胞中的Aβ被迅速降解，從而恢復(fù)細胞活力。因此可以認為，uPA表達的增加可以通過在局部降解或清除致病的Aβ來發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，uPA的異常與AD的病理生理有著密切的聯(lián)系。遺憾的是，本研究利用檢測了LOAD患者及正常對照組外周血清uPA的濃度，結(jié)果顯示LOAD組血清uPA的濃度和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可以認為血清uPA濃度尚不能用來作為AD診斷的標志物。另外，本研究結(jié)果顯示，輕度LOAD患者血清uPA的濃度較中－重度患者高，雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但可以看出隨著AD患者病情的加重血清uPA的濃度呈遞減的趨勢。本課題研究人員分析此現(xiàn)象歸納原因有可能因為:①隨著AD患者病情的發(fā)展，老年斑從只有少許類淀粉樣纖維沉積的早期斑最后可以發(fā)展為中心有致密類淀粉核心的致密斑，隨著AD的病理進展，Aβ在腦組織及血管中的沉淀不斷增多。AD患者血漿 Aβ42濃度會隨之下降［11］。②Tucker H M 等［12］通過在體外細胞培養(yǎng)以及APP轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ聚集體可以增加uPA的mRNA濃度。Davis J等［10］研究也顯示Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌細胞中uPA的表達。綜上，隨著血清Aβ濃度的下降，理論上血清uPA的濃度亦會隨之下降。但近期有研究［13］結(jié)果顯示，AD患者顱內(nèi)的纖溶酶原激活因子的濃度并無改變，通過其抑制因子－1來降低纖溶酶原激活因子的活性。因此，盡管本研究顯示LOAD組血清uPA的濃度和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，接下來仍有必要對LOAD患者血清uPA的活性進行研究。

uPA是由位于10號染色體的長臂上的plau基因編碼，Ertekin-Taner N等［14］研究認為，位于 plau基因第6外顯子上的錯義C→T突變可使脯氨酸變?yōu)榱涟彼?P141L)，此突變可能是一個致病突變，可通過減少uPA的濃度，使Aβ42濃度的增加而發(fā)揮作用。本研究分析了plau基因P141L多態(tài)性對血清uPA濃度的影響，結(jié)果顯示C/T組及C/C組血清uPA濃度顯著高于T/T組，此結(jié)果與Ertekin-Taner N［14］的研究結(jié)果一致?？梢哉J為，plau基因第6外顯子上的錯義C→T突變可減少血清uPA的濃度，對探討AD的發(fā)病機制提供新思路。

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