大鼠抑郁障礙與心血管組織炎性標記物的相關(guān)性研究

陳瑩 常志文 翟艷苓 張勇 楊琳 林文娟

抑郁癥在冠心病患者中頗為常見［1］，已有許多文獻報道抑郁癥對冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有負面影響。早在20世紀30年代，就有醫(yī)師觀察到抑郁癥患者(當時叫憂郁癥melancholia)死于心血管疾病的比例高于常人。近年來對于抑郁癥影響動脈粥樣硬化形成的機制越來越多地成為基礎(chǔ)研究的熱點，部分學者提出抑郁障礙通過炎癥反應(yīng)促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，然而有關(guān)抑郁障礙與炎性標記物相關(guān)性的資料報道較少，且觀點不一致［2-4］。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的激活是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動機制之一，本研究探討抑郁障礙是否通過啟動NF-κB表達來促進冠心病的發(fā)生發(fā)展，以及抗抑郁治療阻斷NF-κB表達能否為臨床治療冠心病開辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑

氟西汀和丙咪嗪(Sigma公司)，血清高敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reaction protein，hsCRP)檢測試劑(上?；骺萍加邢薰?，血清單核細胞趨化 因 子 1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)檢測試劑(RB公司)，鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體、山羊抗鼠MCP-1多克隆抗體，兔抗人κB抑制蛋白(inhibitory kappa B，IκB)多克隆抗體，Actin內(nèi)參(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 動物分組、模型復制及給藥方案

雄性SD大鼠50只，平均體質(zhì)量(175±24)g，2.5月齡，購自北京維通利華實驗動物中心，合格證號 SCXK(京)20050003。于 24℃、12/12 h 光照/黑暗交替實驗環(huán)境飼養(yǎng)，正常飲食，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后，隨機抽簽分為5組，每組10只:CS組為對照組，又給予生理鹽水腹腔注射;CI組也為對照組，給予丙咪嗪10 mg/kg腹腔注射;SS組為游泳應(yīng)激組，給予生理鹽水腹腔注射;SF組為氟西汀干預(yù)組，游泳應(yīng)激同時給予氟西汀10 mg/kg腹腔注射;SI組為丙咪嗪干預(yù)組，游泳應(yīng)激同時給予丙米嗪10 mg/kg腹腔注射。行為絕望大鼠模型參照文獻［5］并加以改進。具體方法如下:每日不定時將大鼠置于水溫10℃、水深為30 cm的水池(2.0 m×1.0 m×1.5 m)中強迫其游泳，連續(xù)21 d，每日1次，每次1只，強迫游泳時間為每次5 min。游泳結(jié)束后迅速用干毛巾、吹風機將游泳大鼠皮毛擦干，然后放回籠中。

1.3 行為學觀察指標

(1)open-field曠場:觀察大鼠水平移動距離、直立動作、探究行為、修飾動作和排泄行為。(2)基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗:計算大鼠的糖水消耗、純水消耗、總液體消耗、糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。(3)體質(zhì)量變化:觀察體質(zhì)量增長量的變化。

1.4 大鼠外周血hsCRP、MCP-1含量測定

應(yīng)激結(jié)束后48 h內(nèi)，將大鼠斷頭處死，應(yīng)用不含抗凝劑真空采血管采集血液3 ml，離心提取上清液，－80℃低溫冰箱保存。血清MCP-1檢測采用酶聯(lián)免疫夾心法(ELISA)，并用自動酶標儀(波長490 nm)分析結(jié)果。

1.5 大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65檢測

分離胸主動脈，留取主動脈弓向下1 cm處血管組織置于10%中性甲醛溶液中固定待檢，另留取血管組織置于－80℃低溫冰箱凍存待檢。石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片、脫蠟、入水，3%H2O2去離子水室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原修復，滴加適當比例兔來源一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢，應(yīng)用真彩色醫(yī)學圖像分析軟件(Image Pro Plus 5.0，Midia Cybemetics公司)對 MCP-1、NF-κB p65 表達結(jié)果進行半定量分析，比較MCP-1、NF-κB p65在不同組間陽性表達的平均面積。

1.6 大鼠血管組織 NF-κB p65、MCP-1、IκB-α 檢測

蛋白電泳應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激前后各組大鼠體質(zhì)量和行為學指標變化

游泳應(yīng)激前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，行為學指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示各組大鼠應(yīng)激前在體質(zhì)量、行為上大致相同。

游泳應(yīng)激后各組大鼠體質(zhì)量增長不同(P=0.001)，SS組大鼠體質(zhì)量增長最低，CS組大鼠體質(zhì)量增長最快，實驗過程中8只大鼠死亡。

游泳應(yīng)激后行為學指標檢測結(jié)果中，各組間也存在不同程度的差異，其中水平活動距離檢測中，SS組和SF組大鼠水平活動距離最短，CS組和CI組大鼠水平活動距離最長(P=0.004);直立動作和探究行為檢測中，SS組、SF組和SI組大鼠得分最低，CS組和CI組大鼠得分最高(P=0.000和P=0.000);修飾動作和排泄次數(shù)檢測中，SS組大鼠得分最高，CS組、CI組、SF組和SI組大鼠得分均明顯低于SS組(P=0.001和P=0.014)(表1)。

2.2 應(yīng)激對各組大鼠液體消耗的影響

應(yīng)激前各組大鼠基線糖水消耗、純水消耗、總液體消耗和糖水偏愛百分比差異均無統(tǒng)計學意義。

游泳應(yīng)激21 d后，SS組的糖水消耗和糖水偏愛百分比都顯著低于CS組、CI組和SF組，而純水消耗量則顯著高于CS組、CI組和SF組，總液體消耗各組間差異無統(tǒng)計學意義。SI組糖水消耗介于SS組和CS組之間，與兩組差異均無統(tǒng)計學意義，糖水偏愛百分比與SS組相同，而顯著低于CS組、CI組和SF組，純水消耗量也與SS組相同，而顯著高于CS組、CI組和SF組，總液體消耗與各組間差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

2.3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量

游泳應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004，P=0.000)，SS組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量明顯高于CS和CI組(表3)。

2.4 免疫組化法檢測應(yīng)激后各組大鼠MCP-1和NF-κB p65 表達

SS組大鼠血管內(nèi)皮細胞MCP-1呈陽性表達，為環(huán)繞胞膜及胞漿內(nèi)棕黃色顆粒，且陽性表達的平均面積顯著高于CS和CI組(P＜0.05)。SI組也可看到部分血管內(nèi)皮細胞MCP-1呈陽性表達，但與CS和CI組差異無統(tǒng)計學意義。NF-κB活化后即發(fā)生核轉(zhuǎn)位，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，SS組大鼠血管內(nèi)皮細胞NF-κB呈陽性表達，為胞核濃染棕黃色顆粒，陽性表達的平均面積顯著高于CS和 CI組(P＜0.05)(表4，圖1～2)。

2.5 蛋白印跡法檢測應(yīng)激后各組大鼠MCP-1和NF-κB p65/IκB-α 表達

檢測大鼠血管組織細胞MCP-1、NF-κB p65水平，CS組和CI組大鼠血管組織細胞MCP-1幾乎無表達，SS組、SI組和 SF組大鼠血管組織細胞MCP-1、NF-κB p65表達水平明顯上調(diào)。胞漿中IκB-α 表達顯著減少(表5)。

表1 應(yīng)激后各組大鼠行為學指標()

表1 應(yīng)激后各組大鼠行為學指標()

注:與CS組比較，aP＜0.05;SS組與SF組或SI組比較，bP＜0.05

?

表2 應(yīng)激后各組大鼠液體消耗實驗()

表2 應(yīng)激后各組大鼠液體消耗實驗()

注:與CS組比較，aP＜0.01;SS組或SF組與SI組比較，bP＜0.01;SF組與SI組比較，cP＜0.01

?

表3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1水平()

表3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1水平()

注:與CS組比較，aP＜0.01

組別 只數(shù) hsCRP(mg/L) MCP-1(ng/L)CS 10 0.15±0.06 22.52± 8.45 CI 7 0.12±0.04 21.42± 6.75 SS 9 0.26±0.07a 52.02±18.83a SF 8 0.21±0.07a 29.68±10.03 SI 8 0.20±0.07a 31.33±12.00 P值0.001 0.000

表4 應(yīng)激后各組大鼠血管組織MCP-1和NF-κB p65表達()

表4 應(yīng)激后各組大鼠血管組織MCP-1和NF-κB p65表達()

注:與CS組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) MCP-1 NF-κB p65 CS 10 25.3±6.1 20.2±5.6 CI 7 25.1±5.0 18.6±5.6 SS 9 35.6±7.5a 31.2±6.5a SF 8 26.6±5.1 25.4±4.4a SI 8 28.0±5.7 23.1±6.2

表5 Western blot檢測各組大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65、IκB-α表達()

表5 Western blot檢測各組大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65、IκB-α表達()

注:與CS組比較，aP＜0.013

組別 只數(shù) MCP-1(IKBA值)NF-κB p65(IKBA值)IκB-α(IKBA值)CS 10 0.85±0.15 0.12±0.04 2.07±0.48 CI 7 0.76±0.08 0.11±0.05 2.03±0.36 SS 9 1.78±0.36a 0.88±0.16a 0.48±0.07a SF 8 1.51±0.23a 1.01±0.23a 1.95±0.47 SI 8 1.76±0.36a 0.91±0.12a 0.45±0.19a P值0.000 0.000 0.000

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，炎癥又是動脈粥樣硬化的基本特征。大量研究表明，冠心病的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)［6-8］。抑郁癥患者體內(nèi)炎性標記物水平的變化是近幾年來各國學者新的發(fā)現(xiàn)，那么抑郁癥和炎癥反應(yīng)誰起始動作用，各國學者們均做了進一步研究［9］。冠心病患者中抑郁障礙頗為常見，因此部分學者提出抑郁障礙通過炎癥反應(yīng)促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，游泳應(yīng)激組大鼠不僅外周血炎性標記物水平增高，而且血管壁炎性標志物NF-κB p65和MCP-1呈陽性表達，NF-κB p65和MCP-1蛋白水平增高，提示抑郁模型建立過程中啟動了炎癥反應(yīng)。

MCP-1基因啟動子中含有 NF-κB結(jié)合位點，NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，主要由p50和p65二亞基所組成。細胞靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB相結(jié)合，使NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中，當細胞受到各種刺激后，IκB發(fā)生快速泛蛋白化及蛋白酶解，NF-κB即被活化，并很快易位到核中，與靶基因的啟動子區(qū)域κB基序結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB對多種促炎癥細胞因子、黏附分子、趨化因子和生長因子等的表達起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。NF-κB參與炎癥過程中的多種信號傳導途徑，并且在動脈粥樣硬化晚期參與平滑肌細胞增殖的生長因子亦由NF-κB調(diào)控，因而認為NF-κB的激活是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動機制之一。本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)激組大鼠血管組織中NF-κB p65和MCP-1表達均增強，血管組織胞漿中 IκB-α 表達下降，表明NF-κB p65核轉(zhuǎn)位是由 NF-κB 的抑制因子 IκB 降解所致，提示NF-κB/IκB信號通路可能介導了大鼠血管組織MCP-1表達，活化的NF-κB p65可能通過促進MCP-1表達而誘導單核細胞黏附于血管壁并穿入內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，形成動脈粥樣硬化早期病理改變。

抑郁癥屬于情感性精神障礙性疾病，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征。本研究對21 d強迫游泳試驗后的大鼠進行了相關(guān)行為學測試，實驗結(jié)果顯示SS組大鼠open-field曠場實驗得分，包括水平移動距離、直立動作和探究行為，以及體質(zhì)量增長均低于正常對照組，而修飾動作和排泄行為均高于正常對照組，反映出游泳應(yīng)激組大鼠處于抑郁情緒狀態(tài)，在行為學方面表明了該模型的成功建立。

本研究選用傳統(tǒng)三環(huán)類抗抑郁藥物丙咪嗪和目前臨床上常用的抗抑郁劑選擇性5-HT重攝取抑制劑氟西汀，對比藥物干預(yù)組大鼠與對照組在炎性標記物方面的差異，分析藥物干預(yù)對于上述檢測指標的影響效果。研究結(jié)果提示抗抑郁劑均發(fā)揮了一定抗抑郁療效，外周血炎性標記物含量檢測和應(yīng)用免疫組織化學染色、Western印跡檢測結(jié)果提示，抗抑郁藥的應(yīng)用可不同程度地減少大鼠外周血炎性標記物含量，下一步的研究應(yīng)設(shè)定不同藥物劑量及增加觀測時間點，進一步明確抗抑郁治療對于動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響。

本研究結(jié)果表明抑郁障礙通過啟動炎癥因子NF-κB表達，在冠心病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，抗抑郁治療可改善抑郁相關(guān)癥狀并可能通過降低外周血、血管組織炎性標記物水平，為冠心病治療提供了新思路。

［1］Frasure-Smith N，Lespérance F.Depression and cardiac risk:present status and future directions.Heart，2010，86:193-196.

［2］Panagiotakos DB， Pitsavos C， Chrysohoou C， et al.Inflammation，coagulation，and depressive symptomatology in cardiovascular disease-free People;the ATTICA study.Eur Heart J，2004，25:492-499.

［3］Davidson KW，Schwartz JE，Kirkland SA，et al.Relation of inflammation to depression and incident coronary heart disease(from theCanadian NovaScotiaHealth SurveyNSHS95 Prospective Population Study).Am J Cardiol，2009，103:755-761.

［4］Pozuelo L，Tesar G，Zhang J，et al.Depression and heart disease:what do we know，and where are we headed?Cleve Clin J Med，2009，76:59-70.

［5］Porsolt RD，Anton G，Blavet N，et al.Behavioural despair in rats:a new model sensitive to antidepressant treatments.Eur J Pharmacol，1978，47:379-391.

［6］Danesh J，Pepys MB.C-reactive protein and coronary disease:is there a causal Link?Circulation，2009，120:2036-2039.

［7］Schillinger M，Exner M，Mlekusch W，et al.Inflammation and carotid artery——risk for atherosclerosis study(ICARAS).Circulation，2005，111:2203-2209.

［8］Deguchi JO，Aikawa M，Tung CH，et al.Inflammation in atherosclerosis:visualizing matrix metalloproteinase action in macrophages in vivo.Circulation，2006，114:55-62.

［9］Empana JP，Sykes DH，Luc G，et al.Contributions of depressive mood and circulating inflammatory markers to coronary heart disease in healthy European men: the Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME).Circulation，2005，111:2299-2305.