超聲評價辛伐他汀的抗兔動脈粥樣硬化作用及其機制的探討

馬娜 任俊紅 任衛(wèi)東 郭發(fā)金

心腦血管病是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理生理學基礎。彩色多普勒超聲檢查是臨床評價外周動脈粥樣硬化的首選方法，腹主動脈位置表淺，走行平直，易于超聲檢查，并且AS發(fā)病率高，可反映全身動脈粥樣硬化的程度。他汀類藥物被認為是一類具有較強抗動脈粥樣硬化作用的藥物，除調脂作用外，還具有其他抗動脈粥樣硬化的作用，仍是目前研究的熱點。本研究應用高頻超聲觀察辛伐他汀對兔腹主動脈AS病變的作用，同時定量測定動脈壁聲學密度值變化，探討超聲評價AS的價值，并分析辛伐他汀降脂作用外，對增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在AS斑塊中表達的影響。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立及分組

健康日本大耳白兔30只，雄雌不限，體質量2.0～2.5 kg，平均(2.21±0.26)kg。純種普通級，3個月齡，許可證號:SYXK(遼)2003-0013。適應性喂養(yǎng)后，采用隨機數(shù)字表法平均分為3組:健康對照組(A組)，喂以常規(guī)兔顆粒飼料;AS模型組(B組)，每日喂以高脂飼料(含l%膽固醇+2%蛋黃粉+5%豬油)100 g后自由攝食顆粒飼料;辛伐他汀(國藥準字H19990366，杭州默沙東制藥，中國)治療組(C組)，喂以高脂飼料(同B組)4周后每日加喂辛伐他汀10 mg/kg。兔單籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂養(yǎng)共16周。預實驗中高脂飼料喂養(yǎng)4周測得血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇顯著增高，8周截取腹主動脈光鏡見早期AS病變，證實初步造模成功。

1.2 血脂水平測定

應用日立7060型全自動生化分析儀以酶比色法測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.3 高頻超聲及聲學密度定量檢測

采用速眠新0.15 ml/kg及戊巴比妥1 ml肌注麻醉，將兔仰臥位四肢固定于檢查床上，常規(guī)聯(lián)接體表心電圖，腹部備皮。應用HP Sonos 5500型超聲診斷儀，高頻探頭頻率7.5 MHz，取樣深度4 cm，調節(jié)側向增益補償和時間增益補償均置于0線，其他各項設置在實驗過程中保持不變。自劍突下至髂總動脈分支處自上而下探查腹主動脈，觀察動脈內膜是否光滑、有無增厚、斑塊部位、大小和回聲特點，彩色多普勒顯示腹主動脈血流，觀察有無湍流及狹窄，啟動脈沖多普勒于腹主動脈管腔中央取樣記錄血流頻譜。測量腹主動脈內膜-中層厚度(intimal medial thickness，IMT)、收縮期血流峰值速度(Vp)。聲學密度定量分析:取樣跟蹤腹主動脈壁感興趣節(jié)段內中膜及同一聲束掃描線管腔、動脈壁外膜，記錄背向散射積分參數(shù)值(單位:dB):管腔(AII-L)、增厚的內中膜(AII-I)、外膜平均回聲強度(AII-A)及內中膜校正回聲強度(AII:AII-I與AII-L的比值)。

1.4 病理形態(tài)學檢查及PCNA、bFGF免疫組織化學分析

超聲檢查后剖腹截取腹主動脈，肉眼觀察并留取標本作HE染色、彈力纖維染色及免疫組織化學染色。光鏡下觀察內膜有無泡沫細胞及斑塊、內彈力膜完整性、平滑肌細胞及彈力纖維增生程度。SABC法免疫組化染色試劑盒，鼠抗兔PCNA單克隆抗體、兔抗兔bFGF抗體(購自武漢博士德生物工程公司)，按試劑盒說明操作，經Meta Morph Image System圖像分析系統(tǒng)處理，觀測內膜bFGF陽性產物平均光密度值、PCNA陽性表達率(即陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比率)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 3組血脂水平比較

16周末A組血脂在正常范圍，B、C組TC、TG、LDL-C顯著增高，C組較B組減低，差異有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)。見表1。

2.2 3組高頻超聲、聲學密度檢測與病理學結果比較

A組高頻超聲檢測腹主動脈壁光滑，未見增厚，血流充盈良好，病理組織學未見明顯病變。B組、C組聲像圖示動脈內中膜毛糙增厚，回聲不均，B組并可見多處自內膜突入管腔的局限性低、中等回聲，彩色血流邊緣不規(guī)整，斑塊部位血流充盈缺損，B組病理可見動脈內膜多層泡沫細胞隆起聚集、彌漫性增厚，表面薄層纖維帽形成，斑塊內平滑肌細胞及彈力纖維增生明顯，并見棒狀膽固醇結晶裂隙，內彈力板扭曲、斷裂。C組病理見散在脂紋、脂斑形成，彈力纖維染色見局部內彈力板改變(圖1～4)。3組兔腹主動脈彩色多普勒顯像未見狹窄改變。

A組動脈壁IMT值小，聲像圖呈線樣，聲學密度值無法測得。B組、C組IMT較A組顯著增高，C組IMT、AII-I、AII值較B組明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(均為 P＜0.05，表2)。

2.3 PCNA、bFGF陽性表達

免疫組織化學檢測A組動脈基本無陽性表達，偶見內膜出現(xiàn)單個散在的陽性細胞。B、C組均可見棕黃色陽性表達，bFGF陽性表達主要存在于增生內膜及中膜層胞漿內，B、C組bFGF平均吸光度值分別為0.23±0.01、0.15±0.07;PCNA陽性表達位于胞核，B、C組陽性表達率分別為 39.38±2.71、20.25±3.05，C組PCNA及bFGF陽性表達較B組顯著減低(均為 P ＜0.05，圖5、6)。

表1 血脂水平比較()

表1 血脂水平比較()

注:與A組比較，aP＜0.05;與B組比較，bP＜0.05

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表2 腹主動脈IMT、Vp、聲學密度值比較()

表2 腹主動脈IMT、Vp、聲學密度值比較()

注:與B組比較，aP＜0.05;與A組比較，bP＜0.05

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圖1 B組B超顯示其AS斑塊處彩色血流信號充盈缺損 圖2 B組AS斑塊形成(HE染色，×200) 圖3 C組腹主動脈壁B超顯示IMT不規(guī)則增厚 圖4 C組脂斑形成(HE染色，×200) 圖5 B組動脈壁PCNA免疫組化染色(×200) 圖6 C組動脈壁PCNA免疫組化染色(×200)

3 討論

血脂異常是AS重要危險因素及啟動步驟，高膽固醇血癥促進脂質過氧化，形成的氧化型低密度脂蛋白為內皮損傷的關鍵成分［1］，內皮功能紊亂被認為是AS始動環(huán)節(jié)，而中膜平滑肌細胞增殖、遷移是AS的重要環(huán)節(jié)，有多種細胞因子參與。PCNA是一種僅在細胞核內增殖細胞中合成或表達的核內酸性蛋白質，與細胞分裂及增殖狀態(tài)顯著相關，可以作為細胞周期中S期細胞數(shù)量的特異性標志，通過檢測PCNA的表達，能較好地反映細胞的增殖活性［2］。bFGF是一種多生物學功能的細胞因子，可影響內皮細胞功能，在AS平滑肌細胞增殖、遷移，表型轉變及促進多種間充質細胞增殖、分化及細胞外膠原纖維合成中發(fā)揮重要作用［3］。本研究16周末A組血脂水平在正常范圍，B組、C組TC、TG和LDL-C水平顯著增高，光鏡下觀察到腹主動脈不同程度AS病理形態(tài)學改變，反映了由內皮損傷、脂類積聚和細胞增殖等引起的AS發(fā)生及進展過程。B組病理可見明顯斑塊形成，bFGF、PCNA陽性表達顯著增多，提示bFGF、PCNA活性增強對內膜增殖的促進作用。辛伐他汀是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑他汀類藥物的一種，在臨床上已廣泛應用，是目前公認的一類最為常用、有效的基礎性降脂藥，他汀類降脂藥物通過抑制肝細胞合成膽固醇的限速酶而降低TC、TG、LDL-C和升高HDL-C水平，改善血管內皮功能，并可能通過其調脂外的阻斷甲羥戊酸的代謝通路而抑制巨噬細胞、白細胞介素、黏附分子等多種炎癥因子的表達，抑制脂質在巨噬細胞內的聚集以及平滑肌細胞的增殖遷移等，在抗AS斑塊形成方面發(fā)揮重要作用［4-5］。本實驗C組TC、TG和LDL-C較B組顯著降低，病理見斑塊形成較B組減少，bFGF、PCNA表達也明顯減低，反映了辛伐他汀不僅具有降脂作用，而且能夠降低bFGF、PCNA表達，抑制細胞增殖，明顯減輕AS進程。

彩色多普勒超聲檢查能夠無創(chuàng)、準確反映斑塊的大小、范圍，血管壁厚度。其中IMT是超聲評價內膜增殖程度的可靠指標，廣泛應用于AS早期及進展期定量分析［6］，本研究超聲檢查顯示B組腹主動脈IMT及AS斑塊較C組顯著增加，與病理形態(tài)學結果一致，反映了高膽固醇高脂血癥對AS的促進作用及辛伐他汀對斑塊消退作用，隨著高頻超聲分辨率的提高及測量方法的標準化，IMT對AS的評價將更加完善。本研究同時應用聲學密度定量技術，獲取超聲波在組織內傳播過程中的原始背向散射信號進行定量分析，當超聲條件一定，血管壁的聲學特性主要由單位組織內膠原、脂質和蛋白質等成分的聲學特性決定［7］，脂質的聲學密度值低，纖維斑塊及鈣化斑聲學密度值較高，本研究中B組動脈壁內膜增厚，平滑肌、膠原大量增殖，彈力纖維排列紊亂，以纖維性斑塊為主要病變特征，斑塊聲學密度測值較高，而C組內膜僅有薄層脂質沉積，平滑肌及膠原含量少，聲學密度測值較B組減低。聲學密度定量技術可以反映動脈斑塊不同組織成分特征，有助于評價斑塊穩(wěn)定性。由于探頭頻率、探測深度、偽差等多方面技術因素影響，絕對值常不能客觀反映組織學差異，因而采用固定儀器條件并計算內中膜校正回聲強度，以盡量消除儀器及個體差異的影響。

高頻超聲顯像及聲學密度檢測能夠定量分析動脈壁形態(tài)學及聲學密度特征，可作為動態(tài)評價AS病變進展及消退的可靠方法。辛伐他汀具有降脂、減低斑塊bFGF、PCNA表達及抑制細胞增殖，延緩AS進程的重要作用。近年斑塊易損性是AS研究熱點，探討超聲評價方法以及他汀類藥物穩(wěn)定斑塊的作用有待進一步研究。

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