同種接合型酵母菌株Y2HGold的原生質(zhì)體融合研究

常登龍，洪 玉，楊永軍，張賀翠，薛麗琰，楊 昆，朱利泉，王小佳(西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715)

同種接合型酵母菌株Y2HGold的原生質(zhì)體融合研究

常登龍，洪 玉，楊永軍，張賀翠，薛麗琰，楊 昆，朱利泉*，王小佳
(西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715)

為避開(kāi)有性融合的局限性，挖掘同種接合型酵母菌株無(wú)性融合的潛在應(yīng)用價(jià)值，利用質(zhì)粒構(gòu)建了酵母雙雜交工程菌株Y2HGold的亮氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型菌株;接著采用酶解法進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)獲得原生質(zhì)體制備方案:酶解溫度30℃、處理時(shí)間80min、預(yù)處理劑含0.1%(w/v)巰基乙醇和0.1%(w/v)EDTA－2Na，酶解液為1.5%(w/v)蝸牛酶和1.5%(w/v)纖維素酶混合，使得原生質(zhì)體的制備及再生率分別達(dá)82%和37%;最后采用PEG誘導(dǎo)融合的方法，經(jīng)過(guò)同樣正交實(shí)驗(yàn)得到Y(jié)2HGold無(wú)性融合條件為:PEG濃度35%、溫度25℃、時(shí)間40min、pH5.8。篩選得到的無(wú)性融合子在遺傳上穩(wěn)定。

酵母，原生質(zhì)體，無(wú)性融合，無(wú)性融合菌株

酵母為單細(xì)胞型真菌，在通常情況下，繁殖體為二倍體，但是在特定條件的誘導(dǎo)下，可以使其產(chǎn)生單倍體孢子并萌發(fā)為單倍體繁殖體。根據(jù)酵母第三號(hào)染色體上特殊等位基因MATa和MATɑ的差異，把單倍體酵母劃分為a和α兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞壁上特定的性凝集素誘導(dǎo)而交配，恢復(fù)為二倍體;如釀酒酵母的a和α兩種類(lèi)型的性凝集素為細(xì)胞的交配提供有利條件(圖1)。a性凝集素包括AGA1p和AGA2p兩個(gè)亞基，分別由兩個(gè)不相連的AGA1和AGA2基因編碼。a性凝集素靠AGA1p亞基來(lái)錨定。其中兩種交配型細(xì)胞都編碼這種亞基，AGA2p亞基只在a型細(xì)胞中表達(dá)，與a凝集互補(bǔ)的α－凝集素則是被單基因SAG1編碼的。同一交配型細(xì)胞之間，因細(xì)胞壁上存在相同凝集因子不能進(jìn)行交配。雜交育種利用了酵母單雙倍生活周期的特點(diǎn)，將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體或多倍體細(xì)胞，而對(duì)于同種接合型的酵母只能通過(guò)誘導(dǎo)融合形成二倍體或多倍體。目前應(yīng)用原生質(zhì)體融合形成二倍體或多倍體的報(bào)道很多［3－5］，大都是將具有不同性狀的兩種或多種酵母菌進(jìn)行融合，未見(jiàn)同種性別單倍體菌無(wú)性融合的相關(guān)報(bào)道，但在對(duì)酵母菌的研究中僅從有性融合或普通融合出發(fā)具有一定的局限性。本文初步探討了同種接合型單倍體酵母菌株Y2HGold無(wú)性融合的條件及與有性融合的對(duì)比，這為發(fā)掘同種接合型酵母菌株無(wú)性融合的潛在價(jià)值提供依據(jù)。

圖1 釀酒酵母黏附素的表達(dá)和配合［1－2］Fig.1 Expression and interactions of sexual adhesins in S.cerevisiae［1－2］

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母雙雜交系統(tǒng)菌株 Y2HGold(a型)、Y187 (α型)、大腸桿菌感受態(tài)DH5α 北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒 TransGen公司;酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System) Clontech公司;SD、SD/－Leu、SD/－Trp、SD/－Leu－Trp 配方見(jiàn) Clontech公司的 Gold yeast two－h(huán)ybrid system系統(tǒng)的說(shuō)明書(shū);高滲完全培養(yǎng)基(YPDS) YPDA+8mol/L甘露醇;LB培養(yǎng)基、液體完全培養(yǎng)基(YEPD)、YPDA培養(yǎng)基(YPD添加0.03g/L腺嘌呤硫酸鹽) 以上培養(yǎng)基均為121kPa，15m in滅菌;蝸牛酶(Snailase)、纖維素酶(Cellulase R－10) 用滲透壓穩(wěn)定劑配制，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，酶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用;0.2mol/L磷酸緩沖液(PB)，0.8mol/L甘露醇溶液，17%(w/v)的蔗糖溶液，0.8mol/L的山梨醇溶液，EDTA－2Na，巰基乙醇，PEG溶液4000，0.01mol/L CaCl2，KCl 0.7mol/L。

Mikro 120(小型微量離心機(jī)M ikro120) 德國(guó)赫提馳(海蒂詩(shī))Hettich;MiniSpin(Eppendorf高速離心機(jī)) 德國(guó)艾本德股份司(Eppendorf);GXZ型智能光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;ZD－85型恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;SW－CJ－1Cμ型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化電器有限公司; ES－315型高壓蒸汽滅菌鍋 日本 Tomy Digital Biology公司;美的 PJ21C－AN微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司;BX51系統(tǒng)顯微鏡 奧林巴斯(日本 OLYMPUS);PCR儀(070－851 Tprofessional Standard Gradient 96) 德國(guó)Biometra;JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的構(gòu)建 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞:參考Clontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)使用說(shuō)明書(shū)(MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System User Manual)標(biāo)準(zhǔn)的操作方法。根據(jù)酵母雙雜交工程菌株Y2HGold基因特點(diǎn)構(gòu)建菌株，將酵母雙雜交體系質(zhì)粒 AD(Activation domain)、BD(DNA－binding domain)運(yùn)用組合轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Y2HGold菌株感受態(tài)細(xì)胞，采用SD/－Leu或SD/－Trp(SD/1)平板進(jìn)行缺陷型篩選及傳代培養(yǎng)，觀察菌株穩(wěn)定性。

1.2.2 親本原生質(zhì)體最適制備與再生條件的單因素實(shí)驗(yàn) 設(shè)置處理溫度為20、25、32、35、40℃，在預(yù)處理劑為0.15%(w/v)、混合酶1.5%(w/v)、酶處理時(shí)間60m in條件下，進(jìn)行原生質(zhì)體制備及再生，初步篩選最適處理溫度。然后，按此處理溫度進(jìn)行最適預(yù)處理劑濃度初步篩選實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置預(yù)處理劑為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%(w/v)，其他條件同上。以此類(lèi)推，按初步篩選的最適處理溫度和預(yù)處理劑濃度進(jìn)行最適混合酶初步篩選，設(shè)置混合酶濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(w/v)。同理設(shè)置酶處理時(shí)間分別為30、40、60、80、90m in，初步確定最適酶處理時(shí)間。

1.2.3 親本原生質(zhì)體制備及再生優(yōu)化 據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取原生質(zhì)體制備的四個(gè)關(guān)鍵因素:酶解溫度、預(yù)處理劑EDTA－2Na+巰基乙醇(w/v)濃度，混合酶蝸牛酶+纖維素酶(w/v)濃度以及酶處理時(shí)間及進(jìn)行四因素三水平正交［6］實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 酵母細(xì)胞原生質(zhì)體制備與再生正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The orthogonal test of the asexualwall－broken condition of protoplasts

取對(duì)數(shù)期菌液活化(細(xì)胞數(shù)達(dá)107～108個(gè)/m L)→離心收集菌體→預(yù)處理劑懸浮→離心清洗菌體→震蕩酶解→緩沖液洗原生質(zhì)體→漲破處理→涂完全培養(yǎng)基，酶解后菌液經(jīng)稀釋后涂高滲培養(yǎng)基→分別培養(yǎng)計(jì)數(shù)，菌體數(shù)計(jì)算采用涂板計(jì)數(shù)和血球計(jì)數(shù)兩種方法，加之OD值校對(duì)。計(jì)數(shù)原生質(zhì)體的形成率［7］:原生質(zhì)體的形成率L(%)=(A－B)/A×100，式中，A:酶前菌體數(shù);B:酶后菌體數(shù)。

原生質(zhì)體的再生采用雙層平板培養(yǎng)法，底層鋪一層含2.5%瓊脂的高滲YPDA培養(yǎng)基，烘箱干燥幾小時(shí)使表面脫水，倒入10m L預(yù)先保溫在40℃的含有0.5%(w/v)瓊脂并混合了 1m L原生質(zhì)體懸液的YPDA高滲培養(yǎng)基。原生質(zhì)體再生率 L(%)= (C－B)/(A－B)×100，式中，A:酶前菌體數(shù);B:酶后菌體數(shù);C:高滲板菌體數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體融合及融合子篩選 采用PEG濃度，融合時(shí)間，溫度及pH四個(gè)關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體的無(wú)性融合條件(表2)，根據(jù)表2將兩親本新制備的原生質(zhì)體各4m L (5×107～10×107個(gè)/m L)等量混合，離心，加等體積不同濃度的PEG4000(含0.01mol/L CaCl2)4m L助融，懸浮原生質(zhì)體并置于不同溫度的水浴鍋上，期間輕輕震蕩，促使融合。融合完成后，1000 r/m in離心10m in，棄上清即獲得融合沉淀物。用0.7mol/L KCl懸浮融合物沉淀并分別稀釋至原樣液體積的(4m L)的10－3、10－2、10－1倍，各取150μL，涂于高滲 SD/－Leu－Trp(SD/2)板上。

表2 原生質(zhì)體無(wú)性融合正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 The orthogonal test results of the asexual fusion condition of protoplasts

先將融合菌體稀釋后全部涂布于高滲YPDA平板上，培養(yǎng)2d待長(zhǎng)出菌落后將所有融合子稀釋洗滌后轉(zhuǎn)接到高滲二缺板(高滲SD/2)選擇性培養(yǎng)基上面，培養(yǎng)得到無(wú)性融合子。

融合率(%)=(高滲SD/2二缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落數(shù)/高滲YPDA上生長(zhǎng)菌落數(shù))×100，數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS13.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的構(gòu)建

采用表3轉(zhuǎn)化法將酵母雙雜交質(zhì)粒AD和BD分別轉(zhuǎn)入酵母雙雜交工程菌株Y2HGold構(gòu)建缺陷型菌株，并將AD和BD質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入Y2HGold觀察兩個(gè)質(zhì)粒的共存情況，在單缺板SD/1(SD/－Leu或SD/－Trp)和二缺板SD/2(SD/－Leu－Trp)上分別經(jīng)過(guò)10代以上傳代培養(yǎng)證實(shí)可以穩(wěn)定遺傳，得到Y(jié)2HGold亮氨酸和色氨酸缺陷型標(biāo)記菌株。

表3 缺陷型菌株的組合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)有無(wú)情況Table 3 The construction of the yeast defective strains

圖2 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒后涂平板結(jié)果Fig.2 The growth of strains on the plate after plasmid transferred

酵母雙雜交工程菌Y2HGold中有由3個(gè)不同的Gal4操縱基因調(diào)節(jié)的4個(gè)完整的報(bào)告基因AUR1－C、HIS3、ADE2和MEL1，而B(niǎo)D質(zhì)粒含有TRP1缺陷篩選基因，AD質(zhì)粒含有LEU2缺陷篩選基因，只有BD和AD質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入的酵母菌才能在SD/－Trp/－Leu選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng);將AD轉(zhuǎn)入Y2HGold獲得能在SD/－Leu培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，BD轉(zhuǎn)入Y2HGold獲得能在SD/－Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，兩菌株的原生質(zhì)體融合子因含有兩個(gè)質(zhì)粒而能在SD/－Leu－Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，由此完成了菌株缺陷性標(biāo)記。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 菌體的不同生理狀態(tài)，直接影響到菌體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、代謝水平及活力等［8］。本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，此時(shí)的細(xì)胞代謝旺盛、生長(zhǎng)率高，菌體細(xì)胞的化學(xué)組成、形態(tài)及生理特征比較一致［9］，Y2HGold的亮氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期均在16～20h之間，具體生長(zhǎng)周期還跟單克隆活性、轉(zhuǎn)接代數(shù)及接種量有關(guān)系。2.2.2 處理溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖3可知，處理溫度為20～25℃，低于Y2HGold最適培養(yǎng)溫度時(shí)，混合破壁酶的酶活性低，原生質(zhì)體形成率低，再生率接近于零，當(dāng)處理溫度為25～32℃時(shí)，混合破壁酶活性逐漸增高，原生質(zhì)體形成率和再生率也大幅增加;當(dāng)處理溫度為32℃時(shí)，混合破壁酶活性最高，原生質(zhì)體形成率高達(dá)82%，再生率達(dá)37%，處理溫度35～40℃時(shí)，原生質(zhì)體形成率減少、再生率亦有下降趨勢(shì)。由此得出，原生質(zhì)體的最適酶解溫度稍高于受體菌的最適生長(zhǎng)溫度。當(dāng)?shù)陀谧钸m酶解溫度時(shí)，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體形成率、再生率呈上升趨勢(shì);當(dāng)高于最適酶解溫度，原生質(zhì)體的形成率、再生率呈下降趨勢(shì)。

圖3 溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.3 The effect of the temperature on the formation rate and regeneration rate of the Y2HGold protoplast

2.2.3 預(yù)處理劑對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 單倍體親株Y2HGold的兩種缺陷型菌株分別經(jīng)YPDA液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行破壁前預(yù)處理，研究其對(duì)原生質(zhì)體形成與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖 4可知，預(yù)處理劑濃度在 0.05%～0.25% (w/v)原生質(zhì)體形成率呈上升趨勢(shì)，原生質(zhì)體形成率則先上升后下降，出現(xiàn)峰值，低濃度0.05%(w/v)預(yù)處理劑處理原生質(zhì)體再生率較高但形成率低，而高濃度0.25%(w/v)預(yù)處理劑使得原生質(zhì)體形成率高但再生率下降，說(shuō)明低濃度預(yù)處理劑不能提高破壁率而高濃度預(yù)處理劑提高原生質(zhì)體形成率的同時(shí)降低了原生質(zhì)體的活性，由圖4可知0.1%EDTA－2Na和0.1% (v/v)巰基乙醇混合預(yù)處理液處理效果最好。

圖4 預(yù)處理劑對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.4 The effect of the pretreatment on the formation rate and regeneration rate of the Y2HGold protoplast

2.2.4 酶量對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 根據(jù)酵母細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分，考慮纖維素酶、蝸牛酶單獨(dú)處理效果不及混合酶處理效果好［10－12］，故本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的兩種酶混合進(jìn)行梯度處理，由圖5可知最佳酶系統(tǒng)為1.5%纖維素酶+1.5%蝸牛酶。低濃度混合酶破壁率低;高濃度混合酶破壁率高，但再生率下降。其他因素不變時(shí)酶量越大，原生質(zhì)體形成率越高但再生率下降［13］，這是因?yàn)橐环矫?，酶中往往含有?duì)原生質(zhì)體有害的酶類(lèi)，酶量增加，雜酶的濃度也會(huì)隨之增加，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)影響原生質(zhì)體的活性;另一方面，酶濃度過(guò)大易使菌體凝集而難于原生質(zhì)體化，而且細(xì)胞脫壁過(guò)于徹底導(dǎo)致原生質(zhì)體的再生率降低。

圖5 混合酶對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.5 The effect of themixed enzyme on the formation rate and regeneration rate of the Y2HGold protoplast

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響 由圖6可知，處理時(shí)間越長(zhǎng)，酶解效果越好，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，酶對(duì)細(xì)胞壁的分解更充分，使原生質(zhì)體形成率增加，但再生率相應(yīng)降低，可能是酶解太久，細(xì)胞過(guò)分解壁，造成細(xì)胞膜破損，不利于原生質(zhì)體的融合和再生，本實(shí)驗(yàn)得出的最佳酶解時(shí)間為80min。

由實(shí)驗(yàn)知，四種關(guān)鍵因素對(duì)原生質(zhì)體制備與再生都會(huì)造成不同程度的影響，采用優(yōu)化的方案才能達(dá)到較好的效果，另外還有其他因素對(duì)原生質(zhì)體的制備及再生有影響，如出發(fā)菌株單克隆的活性、轉(zhuǎn)接代數(shù)及搖菌的接種量、pH、滲透壓穩(wěn)定劑、培養(yǎng)基組成、菌體分散程度和遺傳性等。

2.2.6 親本原生質(zhì)體制備再生正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取原生質(zhì)體制備的四個(gè)關(guān)鍵因素:酶解溫度、預(yù)處理劑濃度，混合酶濃度以及酶處理時(shí)間正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.6 The effect of the enzyme treating time on the formation rate and regeneration rate of the Y2HGold protoplast

表4 酵母細(xì)胞原生質(zhì)體制備與再生正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The orthogonal test results of the yeastwall－broken condition of protoplasts

由表4對(duì)結(jié)果的分析可以看出，各因素影響原生質(zhì)體再生率的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，最佳配比為A2B1C2D3。正交實(shí)驗(yàn)中優(yōu)選的最佳條件也為A2B1C2D3。綜合來(lái)看，酶解時(shí)間和處理溫度對(duì)原生質(zhì)體的制備和再生影響較大，混合酶和預(yù)處理劑次之，綜合考慮選取A2B1C2D3為最佳實(shí)驗(yàn)條件，即最適酶解溫度30℃、最適處理時(shí)間80m in、最適預(yù)處理劑含0.1%(w/v)巰基乙醇和0.1%(w/v)EDTA－2Na，最適酶解液為1.5%(w/v)蝸牛酶和1.5%(w/v)纖維素酶混合，使得原生質(zhì)體的制備及再生率分別達(dá)82%和37%。由表5選取原生質(zhì)體再生率進(jìn)行方差分析結(jié)果顯示:四個(gè)因素間 F值分布于 1.550～11.591，p值由0.000～0.239，說(shuō)明酶解溫度和酶處理時(shí)間對(duì)再生率的影響差異有極顯著性意義，混合酶對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響差異有顯著性意義而預(yù)處理劑對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響差異不顯著。

2.3 原生質(zhì)體無(wú)性融合條件的優(yōu)化

按照表2中四個(gè)關(guān)鍵因素PEG濃度、融合時(shí)間、溫度及pH設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體的無(wú)性融合條件，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 表4再生率正交結(jié)果方差分析表Table 5 The Table 4’s variance analysis

由表6得出PEG濃度對(duì)原生質(zhì)體融合的顯著性影響最大(R=4.8)，而處理時(shí)間(R=3.6)和處理溫度(R=3.9)對(duì)原生質(zhì)體融合影響作用相當(dāng)，pH對(duì)原生質(zhì)體融合影響相對(duì)較小(R=1.4)。表7方差分析結(jié)果顯示:四個(gè)因素間F值分布于32.507～315.711，p值=0.000，說(shuō)明四個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)融合率的影響差異有極顯著性意義，每個(gè)處理的三個(gè)重復(fù)之間(p= 0.0262)不顯著，重復(fù)可用。最后得出因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳融合條件是A2B2C3D2，即PEG35%，pH 5.8，25℃處理40m in的融合條件效果最好，融合率達(dá)12.6×10－6。關(guān)鍵因素PEG是原生質(zhì)體融合誘導(dǎo)劑，PEG濃度與原生質(zhì)體的存活率和融合率有一定關(guān)系，因?yàn)镻EG對(duì)原生質(zhì)體有一定的毒性作用。PEG濃度在30%～35%過(guò)程融合率呈上升趨勢(shì)，PEG濃度35%～40%的過(guò)程融合率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)PEG濃度為35%，融合率達(dá)到峰值。

表6 原生質(zhì)體無(wú)性融合條件正交實(shí)驗(yàn)Table 6 The orthogonal test results of the asexual fusion condition of protoplasts

2.4 無(wú)性融合子的鑒定及其遺傳穩(wěn)定性的初步考察

2.4.1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定 將誘導(dǎo)融合菌液稀釋涂布SD/2二缺培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入酵母菌Y2HGold的BD質(zhì)粒含有TRP1缺陷篩選基因，AD質(zhì)粒含有LEU2缺陷篩選基因，因此只有兩種缺陷型的菌株完全融合，融合菌株同時(shí)含有BD和AD質(zhì)粒時(shí)才能在SD/－Trp/－Leu選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)見(jiàn)圖7。

表7 表6正交結(jié)果方差分析表Table 7 The Table 6’s variance analysis

圖7 融合子菌落圖Fig.7 Colony picture of the fusant

2.4.2 形態(tài)學(xué)鑒定 從二缺平板(SD/2)上挑取菌落體積大小介于親本菌落與親本二倍體體積大小之間的菌落單克隆隔天傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)10次以上，淘汰掉異核融合等各種假融合子，能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的為二倍體或多倍體融合子，用顯微鏡觀察，視野里出現(xiàn)較多的啞鈴型細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在視野中以三維立體“三葉草”結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)，由此再次判定相同接合型的菌株原生質(zhì)體發(fā)生了融合，結(jié)果見(jiàn)圖8。其中兩個(gè)細(xì)胞的融合結(jié)構(gòu)占絕大多數(shù)，三個(gè)細(xì)胞的融合結(jié)構(gòu)較少，還有極少數(shù)三個(gè)細(xì)胞以上的融合結(jié)構(gòu)。由圖8可知大部分細(xì)胞融合比較徹底，兩個(gè)親本細(xì)胞變小成為芽體而子細(xì)胞居中且較大。

圖8 融合子鏡檢圖(×100)Fig.8 Microscopic examination graph of the protoplast after fusion

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳標(biāo)記

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)酵母雙雜交工程菌Y2HGold基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成功構(gòu)建了亮氨基酸、色氨酸缺陷型菌株，避免了運(yùn)用其他標(biāo)記方法帶來(lái)的不便與缺陷，解決了篩選缺陷型菌株工作量大、效率低等問(wèn)題。

3.2 原生質(zhì)體的制備和融合方案

Y2HGold原生質(zhì)體最佳制備方案:酶解溫度30℃，處理時(shí)間80m in、預(yù)處理劑含0.1%(w/v)巰基乙醇和 0.1%(w/v)EDTA－2Na，酶解液為 1.5% (w/v)蝸牛酶和1.5%(w/v)纖維素酶;Y2HGold無(wú)性融合最佳條件為:PEG濃度35%、溫度25℃、時(shí)間40m in、pH5.8。

3.3 無(wú)性融合與有性融合區(qū)別

挑取SD/2篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)的同種接合型的融合菌株與有性條件得到的二倍體菌株(見(jiàn)圖9)進(jìn)行比較，從融合菌株的顯微結(jié)構(gòu)上看得到無(wú)性融合子“三葉草”結(jié)構(gòu)圖中的子細(xì)胞較有性融合子的子細(xì)胞普遍偏大、母細(xì)胞偏小，而有性融合子的子細(xì)胞與母細(xì)胞大小相當(dāng)，這說(shuō)明在融合子形態(tài)上表現(xiàn)為無(wú)性融合比有性融合可能更為徹底;在時(shí)間上無(wú)性融合可以在短短的40min內(nèi)融合，有性融合則需要20～24h，但在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)性融合子在SD/2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢、周期偏長(zhǎng)，這說(shuō)明aa和αα跟aα相比具有生長(zhǎng)劣勢(shì)。

圖9 酵母雙雜交工程菌Y187與Y2HGold的有性融合子(×100)Fig.9 Microscopic examination graph of the MatchmakerTM Gold Yeast Two－Hybrid System strain Y187 and Y2HGold sexual fusant

綜上，本實(shí)驗(yàn)初步說(shuō)明了同種接合型酵母菌株無(wú)性融合的可能性及融合條件，為探索酵母無(wú)性融合的潛在應(yīng)用價(jià)值、解決接合型的限制及有性融合時(shí)因不同菌株生長(zhǎng)周期不同而帶來(lái)不便等問(wèn)題提供了一定的理論及實(shí)踐依據(jù)。

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Protoplast fusion between the same mating type strains of Y2HGold

CHANG Deng－long，HONG Yu，YANG Yong－jun，ZHANG He－cui，XUE Li－yan，YANG Kun，ZHU Li－quan*，WANG Xiao－jia
(College of Agronomy and Biotechnology Southwestern University，Chongqing 400715，China)

In order to avoid the lim itations of sexual fusion and find out the potential value of asexual fusion between yeast strains of same m ating type，the MatchmakerTMGold Yeast Two－Hyb rid System strain Y2HGold were chosen as the material，using the p lasm id，the leucine－deficient and tryp tophan－deficient strains of Y2HGold were successfully constructed;using orthogonal test w ith four factors and three levels by enzymolysis method，the p reparation p rotocolof deficient－bacteria p rotop lasts was conc luded as:enzymolysis tem perature of 30℃，80m in p rocessing tim e，p re－treatment agent containing 0.1%(w/v)mercap toethanol and 0.1%(w/v)EDTA－2Na，hyd rolyzate a m ixture of 1.5%(w/v)and 1.5%snail enzyme(w/v)cellulase，rendering the p rotop last p reparation and regeneration rate 82%and 37%respec tively.Finally，using PEG－induced fusion m ethod and the same orthogonal test，we ob tained the requirem ents about asexual fusion of Y2HGold:35% PEG concentration，temperature as 25℃ and 40m in and pH5.8.Sub－c lones we selected were genetically stab le.

yeast;p rotop last;asexual fusion;asexual fusion strains

TS201.3

A

1002－0306(2012)12－0233－06

2011－09－09 *通訊聯(lián)系人

常登龍(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

重慶市自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(cstc2012jjB80010);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971849);國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(091063509)。