鹿茸多糖分離純化及抗氧化活性研究

趙玉紅，金秀明，韓 睿

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150040)

鹿茸多糖分離純化及抗氧化活性研究

趙玉紅，金秀明，韓 睿

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150040)

采用DEAE－52離子交換層析和Sepharose CL－6B凝膠排阻層析對(duì)鹿茸粗多糖進(jìn)行分離純化，并通過(guò)對(duì)DPPH自由基、羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(·)清除能力和還原能力的測(cè)定，研究了粗多糖及純化后多糖的抗氧化能力。結(jié)果表明:DEAE－52離子交換層析和Sepharose CL－6B凝膠排阻層析對(duì)鹿茸多糖分離效果較好，可以分離純化得到一種單一多糖;粗多糖和純化后多糖對(duì)DPPH·、·OH·均有清除作用，且具有一定的還原能力，純化后多糖抗氧化活性和還原能力均大于粗多糖。

鹿茸，多糖，分離純化，抗氧化

多糖是一類天然高分子化合物，與蛋白質(zhì)、核酸共同列為最基本的三大生命物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多糖的生物功能逐漸被人們認(rèn)識(shí)，它存在于植物、微生物、藻類及動(dòng)物體內(nèi)。近年來(lái)，從自然資源中提取分離出的多糖在生物化學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域已引起廣泛關(guān)注［1］，它在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞的識(shí)別及細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫娑及l(fā)揮著巨大作用，具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管系統(tǒng)等功能［2］。鹿茸是雄性梅花鹿或馬鹿頭上一對(duì)尚未骨化的幼角，末端呈圓形，表面有絨狀絨毛，內(nèi)部是結(jié)締組織和軟骨組織，代謝旺盛，具有生長(zhǎng)速度快，可再生的特點(diǎn)［3］。鹿茸作為藥材應(yīng)用在中國(guó)已有上千年的歷史，是滋補(bǔ)強(qiáng)壯佳品?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》對(duì)其都有記載，《中國(guó)藥典》中介紹鹿茸的功能為“壯腎陽(yáng)，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒”［4］。鹿茸中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、磷脂、膽固醇等多種活性物質(zhì)。人們對(duì)鹿茸多糖的活性進(jìn)行了研究，為鹿茸的開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。王本祥等［5］對(duì)胃潰瘍老鼠喂食鹿茸多糖提取物，發(fā)現(xiàn)鹿茸多糖對(duì)多種類型胃潰瘍均有明顯治療作用。陳曉光［6］通過(guò)對(duì)肝損傷小鼠的研究，證明鹿茸多糖具有抗肝損傷及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。Sunwoo［7］等對(duì)馬鹿茸中蛋白多糖進(jìn)行分離純化，經(jīng)電泳圖譜分析證明鹿茸中至少含有三種蛋白多糖。本文以梅花鹿茸為原料制備鹿茸多糖(PAPS)，采用DEAE－52離子交換層析和CL－6B瓊脂糖凝膠層析進(jìn)行分離純化，并通過(guò)體外抗氧化能力實(shí)驗(yàn)，考察了粗多糖及純化后多糖的抗氧化活性，以期為進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為鹿茸多糖的應(yīng)用及研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿茸 黑龍江省大莊園集團(tuán)提供;DEAE－52纖維素交換樹(shù)脂 美國(guó) Whatman公司; Sepharose CL－6B 美國(guó)Pharmacia公司;MD－44透析袋、DPPH 美國(guó)Sigma公司;鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵和鐵氰化鉀等 均為分析純，天津東正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

TU－1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HL－2數(shù)顯恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;BSZ－100電腦自動(dòng)部分收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿茸多糖的提取 新鮮鹿茸脫皮，去血后切成1～2cm3的小塊，冷凍干燥24h，粉碎，過(guò)40目篩得鹿茸粉末。取一定量鹿茸粉末，石油醚浸泡12h脫脂，之后加入20倍體積0.2mol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液100℃提取4h，4000r/min離心15min，連續(xù)提取兩次，合并上清液，濃縮到原體積的1/3～2/3，加入3倍體積95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?℃浸泡12h，離心，收集醇沉物，至通風(fēng)處晾干后，將沉淀物加水復(fù)溶，用sevage法除蛋白2～3次，透析48h，濃縮，冷凍干燥得鹿茸粗多糖。

1.2.2 離子交換層析 鹿茸多糖初級(jí)分離純化采用DEAE－52離子交換柱。稱取鹿茸多糖80mg，溶于10m L蒸餾水中，4000 r/m in離心10m in，取上清液上樣，依次用蒸餾水，0.3、0.5、0.7、1mol/L NaCl溶液梯度洗脫，流速控制為 0.5m L/min，分管收集，每管5m L，苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)多糖含量，繪制洗脫曲線，合并同一吸收峰的洗脫液，蒸餾水透析24h，減壓濃縮，冷凍干燥，即得DEAE－52純化多糖。

1.2.3 凝膠排阻層析 鹿茸多糖進(jìn)一步分離純化采用Sepharose CL－6B凝膠排阻層析柱。將經(jīng)DEAE－52分離后的多糖溶于蒸餾水，濃度為10mg/m L，以2m L/次上樣，蒸餾水洗脫，流速控制為30m L/h，每管5m L，苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)，繪制洗脫曲線，收集、合并相同洗脫組分，透析，冷凍干燥即得 Sepharose CL－6B純化多糖。

1.2.4 鹿茸多糖紫外掃描 將Sepharose CL－6B純化后精制多糖配成一定濃度溶液，190～400nm下進(jìn)行紫外光譜掃描，以蒸餾水作空白。

1.2.5 鹿茸多糖抗氧化活性

1.2.5.1 清除DPPH·能力測(cè)定 取不同濃度的樣品溶液2m L和0.2mmol/L DPPH乙醇溶液2m L，加入同一具塞試管中，混勻后室溫避光反應(yīng) 30m in，在517nm下測(cè)吸光值A(chǔ)i;2m L DPPH溶液加2m L蒸餾水的吸光值為Ao;2m L無(wú)水乙醇加2m L樣品溶液吸光值為Aj，同時(shí)以等體積的蒸餾水和無(wú)水乙醇混合調(diào)空白［8］。自由基清除率根據(jù)下列公式計(jì)算:

1.2.5.2 清除羥基自由基(·OH)能力測(cè)定 采用Fenton反應(yīng)［9］，分別在試管中加入各濃度樣品溶液1m L，6mmol/L FeSO41m L，6mmol/L水楊酸乙醇溶液1m L，6mmol/L H2O21m L，混勻，37℃水浴加熱30m in，510nm下測(cè)吸光值A(chǔ)i，將體系中樣品溶液改為1m L蒸餾水，測(cè)得吸光值A(chǔ)o，將體系中H2O2用蒸餾水代替，測(cè)得吸光值A(chǔ)j。

1.2.5.4 還原能力測(cè)定 取不同濃度樣品溶液1m L，加入2.5m L pH6.6磷酸鹽緩沖液及2.5m L 1%的鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴20min，迅速冷卻，加入2.5m L 10%的三氯乙酸，以4000 r/min離心7m in，取上清液2.5m L，依次加入2.5m L蒸餾水，0.5m L 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10min，在700nm處測(cè)體系吸光值。吸光值大小與樣品溶液還原能力呈正相關(guān)［11］。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，所得結(jié)果為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s，n=3)，采用Excel2003及 Minitab16數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換柱層析純化

鹿茸粗多糖經(jīng)DEAE－52離子交換柱層析后，分離結(jié)果如圖1所示。

圖1 鹿茸多糖DEAE－52的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of antler polysaccharide on DEAE－52 chromatography

由圖1可知，離子交換層析后得到4個(gè)洗脫峰，分別為蒸餾水、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl和0.7mol/L NaCl洗脫部分，依次命名為PAPS1、PAPS2、PAPS3、PAPS4，其中PAPS3峰面積較大，含量最多，收集此部分洗脫液，透析后冷凍干燥，進(jìn)行凝膠排阻層析。

2.2 凝膠排阻層析柱純化

對(duì)于經(jīng)過(guò)離子交換層析得到的組分PAPS3，雖然洗脫峰上較為對(duì)稱。但是在分子水平上，其分子量分布、殘留片段以及結(jié)構(gòu)并不一致。因此，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的精細(xì)結(jié)構(gòu)研究。多糖 PAPS3過(guò)Sepharose CL－6B柱，洗脫曲線如圖2所示。

圖2 鹿茸多糖Sepharose CL－6B的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of antler polysaccharide on Sepharose CL－6B chromatography

鹿茸多糖PAPS3經(jīng)進(jìn)一步純化后得到兩個(gè)洗脫峰，PAPS3a和PAPS3b。由圖2可知，PAPS3b含量較少，因此不做后續(xù)深入研究。收集PAPS3a組分，進(jìn)行純度鑒定。

2.3 鹿茸多糖紫外掃描圖譜

對(duì)經(jīng)Sepharose CL－6B分離純化后的多糖進(jìn)行紫外掃描，其掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 PAPS3a紫外掃描光譜Fig.3 UV spectrum of PAPS3a

由圖3可知，分離純化后的鹿茸多糖在190nm處有明顯的多糖特征吸收峰，在260nm和280nm沒(méi)有明顯的吸收峰，表明PAPS3a基本無(wú)蛋白質(zhì)和核酸雜質(zhì)存在。此結(jié)果與錢(qián)韻旭等［12］對(duì)純化后白花蛇草多糖進(jìn)行紫外光譜分析結(jié)果一致，說(shuō)明PAPS3a純度較高。

2.4 鹿茸多糖抗氧化活性分析

2.4.1 清除DPPH·能力分析 DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其溶液在517nm處有強(qiáng)吸收，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光法進(jìn)行定量分析，評(píng)價(jià)目標(biāo)物抗氧化活性強(qiáng)弱［13］。

由圖4可知，PAPS及PAPS3a對(duì)DPPH·均有清除作用，且隨質(zhì)量濃度增加而增大，其中多糖活性順序?yàn)镻APS3a＞PAPS。PAPS在該體系中的半抑制濃度IC50為8.9mg/m L，PAPS3a的IC50為7.0mg/m L。采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，兩者對(duì)DPPH·清除能力差異顯著(p＜0.05)。當(dāng) PAPS3a濃度為12mg/m L時(shí)，DPPH·清除率為75.3%。劉曉寧［14］對(duì)魚(yú)頭中多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，得知當(dāng)多糖濃度為4mg/m L時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最大為45.8%，此后，隨著濃度的增加，清除率逐漸降低。說(shuō)明PAPS3a具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖4 鹿茸多糖清除DPPH·能力比較Fig.4 Scavenging effect of antler polysaccharides on DPPH·

2.4.2 清除羥基自由基(·OH)能力分析 ·OH是最活潑的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基。它可以與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，且反應(yīng)速度極快，對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA破壞最大［15］。

由圖5可知，當(dāng)質(zhì)量濃度小于4mg/m L時(shí)，二者對(duì)自由基清除率相差不多，超過(guò)4mg/m L后，PAPS3a清除自由基能力明顯高于PAPS。在一定范圍內(nèi)，PAPS及PAPS3a對(duì)·OH清除能力隨質(zhì)量濃度增加不斷增大，當(dāng)濃度大于10mg/m L時(shí)，清除率隨濃度增大幅度減緩。PAPS在該體系中的IC50為7.8mg/m L，PAPS3a的 IC50為6.6mg/m L。兩者差異顯著(p＜0.05)。當(dāng)濃度為12mg/m L時(shí)，PAPS3a對(duì)·OH清除率可達(dá) 86.4%。葉明等［16］對(duì)黑芝胞體多糖清除·OH能力分析得知，當(dāng)多糖濃度為40mg/m L時(shí)，·OH清除率為39.8%?！H是活性氧的一種，在人體內(nèi)生物活性最活潑，許多疾病的產(chǎn)生與引發(fā)都與其有關(guān)，如腫瘤、癌癥、炎癥、衰老、動(dòng)脈粥樣硬化等大多是因?yàn)樽杂苫貌坏郊皶r(shí)地消除而引起的［17］。鹿茸多糖PAPS及PAPS3a對(duì)·OH都有明顯的清除作用，且作用較強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明鹿茸多糖具有較強(qiáng)的生物活性。

圖5 鹿茸多糖清除·OH能力比較Fig.5 Scavenging effect of antler polysaccharides on·OH

2.4.3 清除超氧陰離子(O2－·)能力分析 鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，釋放出超氧陰離子，當(dāng)釋放出的超氧陰離子受到抑制或清除時(shí)，就可以阻止中間產(chǎn)物的積累。因此可以通過(guò)鄰苯三酚自氧化速率計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率［18］。

由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，PAPS和PAPS3a對(duì)超氧陰離子清除率都增大，質(zhì)量濃度小于6mg/m L時(shí)，兩種多糖對(duì)超氧陰離子清除率相差不大;質(zhì)量濃度大于6mg/m L時(shí)，PAPS3a對(duì)·清除率大于PAPS。PAPS在該體系中的IC50為9.4mg/m L，PAPS3a的 IC50為 7.8mg/m L，兩者差異顯著(p＜0.05)。當(dāng)PAPS3a濃度為10mg/m L時(shí)，對(duì)·清除率為62.5%。有報(bào)道稱［19］，當(dāng)濃度為10mg/m L時(shí)，破壁靈芝孢子多糖對(duì)·清除率為 59.3%。說(shuō)明PAPS3a具有較強(qiáng)的清除·的能力。

圖6 鹿茸多糖清除超氧陰離子自由基的能力比較Fig.6 Scavenging effect of antler polysaccharides on superoxide radical

2.4.4 還原能力分析 一般情況下，樣品的還原力與抗氧化活性有明顯相關(guān)性?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)自身的還原作用給出電子從而清除自由基。還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。通常采用鐵氰化鉀氧化樣品來(lái)表征還原力，體系中Fe3+在抗氧化劑的促進(jìn)下變成Fe2+，形成的Fe2+在700nm處有吸收峰檢出。最終測(cè)定的吸光值越大，還原力越強(qiáng)［20］。因此，一種物質(zhì)的還原力可作為考察其潛在抗氧化能力的重要指標(biāo)。

由圖7可知，鹿茸多糖的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，PAPS3a還原力大于PAPS。當(dāng)多糖濃度為12mg/m L時(shí)，吸光值(700nm)分別為0.508和0.302，兩者差異顯著(p＜0.05)。破壁靈芝孢子多糖在濃度為5mg/m L時(shí)，還原力的吸光值為0.942［19］。由以上結(jié)果可知，鹿茸多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，與一些動(dòng)物性或植物性多糖相比，具有較強(qiáng)的清除自由基能力，但還原力相對(duì)弱一些。

圖7 鹿茸多糖還原能力比較Fig.7 Reducing effect of antler polysaccharides

3 結(jié)論

從鹿茸中提取的粗多糖，經(jīng)DEAE－52離子交換層析洗脫后分離出四種多糖組分:PAPS1、PAPS2、PAPS3、PAPS4;主要組分 PAPS3經(jīng)過(guò) Sepharose CL－6B凝膠排阻層析后得到單一多糖組分PAPS3a。紫外掃描表明該方法體系精制的鹿茸多糖純度較高，可作為鹿茸多糖純化的有效方法。PAPS和PAPS3a對(duì)DPPH·、·OH、·都有一定的清除作用，鹿茸純化多糖抗氧化活性優(yōu)于粗多糖。

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Purification and antioxidant activity of polysaccharide from velvet antler

ZHAO Yu－h(huán)ong，JIN Xiu－m ing，HAN Rui
(College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

DEAE－52 ion－exchange column chromatog raphy and Sepharose CL－6B gel exc lusion chromatog raphy were used to isolate the crude polysaccharide.Antioxidant activities of the crude and purified polysaccharide were evaluated through their capability of scavenging DPPH·，·OH，· rad icals and reducing power.The result showed that，DEAE－52 ion－exchange column chromatography and Sepharose CL－6B gel exc lusion chrom atog raphy were suitab le for separating and purifying polysaccharide from velvet antlers，a kind of purified polysaccharide was isolated from the crude polysaccharide.Both of the polysaccharide crude and purified had significanteffecton scavenging DPPH·，·OH，·radicals and also had reduction ability.Furthermore purified polysaccharide had m ore ac tivity antioxidant than c rude polysaccharide.

antler;polysaccharide;isolation and purification;antioxidation

TS201.2+3

A

1002－0306(2012)12－0155－04

2011－10－10

趙玉紅(1968－)，女，博士，副教授，研究方向:林特產(chǎn)品精深加工。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項(xiàng)目(11553036)。