食品級微生物降解雙酚A的研究

沈麗金，劉新杰，姚衛(wèi)蓉

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

食品級微生物降解雙酚A的研究

沈麗金，劉新杰，姚衛(wèi)蓉*

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

以食品級微生物為目標，篩選得到6株對雙酚A有降解效果的菌種。針對其中的羅伊式乳桿菌，詳細研究了培養(yǎng)條件對雙酚A降解效果的影響，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中雙酚A濃度1000μg/kg、初始pH6.5、接種量0.1%，37℃下培養(yǎng)32h后的降解率可達69.90%。說明該菌具有較好的雙酚A降解特性。

雙酚A，食品級微生物，羅伊式乳桿菌，降解

雙酚A，全稱4，4－二羥基二苯基丙烷(BPA)，是一種重要的化工原料，主要用于生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、聚砜樹脂、聚苯醚樹脂、不飽和聚酯樹脂等多種高分子材料。而雙酚A具有明顯的雌激素效應，以及一定的生殖毒性［1］，特別是研究發(fā)現(xiàn)雙酚A作為塑料奶瓶的原材料可能會影響嬰幼兒的生長發(fā)育［2－3］。2008年，加拿大首先將雙酚A列入有毒化學物質，并禁止用于嬰幼兒奶瓶中［4］。我國衛(wèi)生部發(fā)布公告，自2011年6月起禁止雙酚A奶瓶的生產(chǎn)，9月起禁止進口含雙酚A的嬰幼兒奶瓶。人們也在試圖尋找雙酚A的控制手段。目前，對于雙酚A的控制方法大致分為微生物降解、化學方法、物理吸附。曾有報道從污水處理廠污泥中分離得到木糖氧化無色桿菌，在培養(yǎng)基體系中得到最大降解率為46.93%［5］。經(jīng)河水里分離得到的銅綠色假單胞菌顯示出90%的降解效率［6］。除了細菌，白腐真菌在自然白洋淀水中6d可以將雙酚A完全降解［7］。也有人利用紫外光降解雙酚A，降解率可達到97%［8］。到目前為止，關于雙酚A的微生物降解展開的研究并不少，但多集中于致病菌和非食品級菌種，如惡臭假單胞菌、新鞘氨醇桿菌、白腐真菌、木糖氧化無色桿菌等［5－6，9－10］。本文針對在食品包裝材料使用過程中已經(jīng)遷移進入食品的雙酚A，以食品級微生物為目標篩選雙酚A的高效降解菌，并研究其最優(yōu)降解條件，探索在食品加工過程中采用食品級微生物降解已有污染物的方法，也為研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品加工過程中原有微生物對化學污染物的原位降解提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌等菌株 本實驗室自行篩選、分離、純化得到，并經(jīng)過鑒定;基礎培養(yǎng)基 葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉浸取物(牛肉膏)10.0g，酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二胺2.0g，吐溫－80 1.0m L，磷酸氫二鉀2.0g，無水硫酸鎂0.283g，一水合硫酸錳0.189g，蒸餾水1.0L。

固相萃取柱 C18柱 LC－C18SPE小柱，規(guī)格為500mg、3m L/50pcs，上海安譜公司的CNWBOND。

1.2 含雙酚A培養(yǎng)基的制備

為了雙酚A溶解，先配制90%的乙醇，稱取一定量的雙酚A純品，溶解，得到雙酚A乙醇溶液，并用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌;為了使雙酚A充分溶解于培養(yǎng)基中，又避免過量的乙醇對菌種的生長代謝造成一定的影響，雙酚A乙醇溶液和配制好的基礎培養(yǎng)基按照1∶20(V∶V)的比例混合，得到含雙酚A培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中雙酚A的含量參照GB9685－2008食品包裝材料特定遷移量的規(guī)定以600μg/kg為基準，按照具體實驗操作作適當調整。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化 按0.2%的接種量接種，37℃下培養(yǎng)24h為一代，培養(yǎng)兩代為活化完全?；罨玫木N接種到雙酚A培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)。

表1 六種食品級微生物對雙酚A的降解效果Table 1 The degradation of BPA from six food－degree strains

1.3.2 微生物降解雙酚A及其影響因素的研究

1.3.2.1 微生物降解雙酚A的培養(yǎng)過程 配制不同濃度的雙酚A培養(yǎng)基(150～1200μg/kg)接種一定量的活化菌種，在不同的初始pH下，以120 r/m in振蕩速度搖瓶培養(yǎng)一定時間后，測定培養(yǎng)液中雙酚A的殘留量W1。以不接菌的含雙酚A培養(yǎng)基為空白對照，雙酚A的含量記為W0。

1.3.2.2 培養(yǎng)時間的影響 配制培養(yǎng)基濃度為600μg/kg，調節(jié)初始pH為6.5，取活化后的菌種，按照0.2%的比例接種，在120r/min的搖床中，37℃培養(yǎng)，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。每隔4h取樣，待處理。

1.3.2.3 初始濃度的影響 按照倍比稀釋的方法，分別配制1200、600、300、150μg/kg濃度的雙酚A培養(yǎng)基，調節(jié)初始pH為6.5，取活化好的菌種，按照0.2%的接種量接種，在37℃下，120r/min的轉速搖床培養(yǎng)，32h后終止培養(yǎng)，取樣，待處理。以不接菌的底物作為空白對照，在相同的條件下培養(yǎng)并測定BPA濃度。

1.3.2.4 初始pH的影響 配制一定量的濃度為1000μg/kg的雙酚A培養(yǎng)基，分裝，用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH溶液調節(jié)pH，配制成pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的培養(yǎng)基，取活化好的菌種，按照0.2%的接種量接種，以不接菌的底物作為空白對照，均在37℃下，120 r/m in的轉速搖床培養(yǎng)，32 h后終止培養(yǎng)，取樣，待處理。

1.3.2.5 接種量的影響 配制基礎培養(yǎng)基，調節(jié)pH為6.5，加入雙酚A溶液，得到BPA濃度為1000μg/kg的雙酚A培養(yǎng)基，取活化好的菌種，按照接種量為0.03%，0.07%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%進行接種，以無菌水補足接種量不同造成的體積差。以不接菌的底物作為空白對照，在37℃下，120 r/m in的轉速搖床培養(yǎng)，32h后終止培養(yǎng)，取樣，待處理。

1.3.2.6 溫度的影響 配制BPA濃度為1000μg/kg的雙酚A培養(yǎng)基，調節(jié)pH為6.5，取活化好的菌種，按照接種量為0.1%的量進行接種，分別在不同溫度(25、30、37、40℃)下，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，120r/min的轉速搖床培養(yǎng)，32h后終止培養(yǎng)，取樣，待處理。

1.3.3 培養(yǎng)液中雙酚A的提取與凈化 經(jīng)微生物發(fā)酵得到的培養(yǎng)液經(jīng)8000r/min、4℃離心10min，收集上清液;再采用固相萃取C18小柱萃取純化培養(yǎng)液中的雙酚A。

C18小柱在萃取前需要進行活化。用6m L甲醇和6m L超純水依次分別以5m L/m in的速度活化C18柱;活化后取20m L培養(yǎng)上清液，以5m L/m in的流速流經(jīng)柱子，使雙酚A吸附到柱子上;用6m L甲醇(10%)以5m L/m in流速沖洗小柱，去除雜質;分別兩次用3m L甲醇以5m L/m in流速洗脫雙酚A，收集洗脫液，進行HPLC檢測。

1.3.4 雙酚A含量的測定 待測液采用高效液相色譜法測定［11］。

液相色譜測定條件:symmetry C18色譜柱，進樣量5μL，流速1.0m L/m in，流動相:乙腈∶水(45∶55);熒光檢測器，激發(fā)波長:227nm，吸收波長:313nm。

峰面積(X)與雙酚A濃度(Y)的關系:Y(μg/ kg)=15.557X－35.622，相關系數(shù)R2=1.0000。

1.3.5 雙酚A降解率的計算 降解率(%)=(W0－W1)/W0×100

其中，W1是實驗樣品雙酚A殘留量;W0為空白對照組雙酚A含量。

2 結果與討論

2.1 雙酚A降解菌種的篩選

活化好的菌種按照0.2%的量接種到雙酚A培養(yǎng)基(650μg/kg)中，37℃搖床培養(yǎng)，48h后取出，檢測并計算降解率。三次平行實驗結果如表1。

由表1可見，6株食品級微生物菌株對雙酚A都有一定的降解效果，其降解率從20%到65%不等。其中短乳桿菌降解雙酚A前后的HPLC圖譜如圖1所示，在11.10m in左右的出峰即是BPA的峰，a、b分別表示空白對照及降解后的峰。圖1中b的峰高明顯偏低，BPA的峰面積減少，說明BPA含量降低了。綜合看來，降解效果最佳的菌種為羅伊式乳桿菌。因此選擇羅伊式乳桿菌作為進一步實驗用菌種。

圖1 短乳桿菌降解雙酚A的HPLC圖譜(48h)Fig.1 The HPLC chromatography of degradation of Bisphenol A by Lactobacillusbrevis(48h)

實驗因批次問題，HPLC檢測采用的C18柱的型號不同，造成BPA出峰時間不同，但每批次檢測均以BPA標準品測定為對照，實驗結果具有可靠性。

2.2 雙酚A時間降解曲線的研究

由圖2表示羅伊式乳桿菌的雙酚A降解趨勢，隨著時間的延長，雙酚A含量不斷減少，在32～40h后雙酚A含量趨于平穩(wěn)?？紤]到實驗周期及有效性，選取32h作為降解時間點。圖3所示為32h點的菌種降解HPLC圖譜。

圖2 雙酚A的時間降解曲線圖Fig.2 Time－course degradation of bisphneol A

圖3 羅伊式乳桿菌降解雙酚A的HPLC圖譜(32h)Fig.3 The HPLC chromatography of degradation of bisphenol A by Lactobacillusreuteri(32h)

2.3 培養(yǎng)液初始pH對BPA降解的影響

由圖4所示，菌種降解雙酚A的最適pH范圍在6～7之間，其降解效率達到50.01%。pH過高過低都將影響菌種的降解效率，當pH為5和9時，其降解效率分別為20.78%和16.08%。推測可能是pH過高或過低影響菌代謝過程中酶的活性，抑制或使酶部分失活，導致降解性能降低。

圖4 培養(yǎng)液初始pH對雙酚A降解的影響Fig.4 The effect of pH on the BPA degradation

2.4 裝液量對BPA降解的影響

裝液量是影響培養(yǎng)基中溶氧量從而影響菌種生長及降解效果的一個間接因素。本實驗在250m L錐形瓶中分別加入50、100、150、200m L的培養(yǎng)液。

根據(jù)圖5所示結果，裝液量為50～100m L之間，降解性能較好，達到61.12%，且處于平緩趨勢，裝液量大于100m L，雙酚A降解效率趨于下降。裝液量過大，可能導致培養(yǎng)基溶氧量下降，間接影響菌種對雙酚A的降解效率。

2.5 接種量對BPA降解的影響

由圖6可知，接種量從0.03%到0.07%，雙酚A降解率呈快速上升趨勢。種量從0.07%到0.2%范圍內(nèi)，降解效果較好，在接種量為1.0%時，降解效果最佳，降解率為63.00%。當接種量為達0.2%時，雙酚A降解率下降至58.68%。推測當接種量較少時，菌種在一定時間內(nèi)繁殖有限，影響整個培養(yǎng)基中雙酚A的降解率。而當接種量超過一定范圍，菌種繁殖過多，可能造成營養(yǎng)匱乏，相對于降解雙酚A能力有一定下降。

圖5 裝液量對雙酚A降解的影響Fig.5 The effect of liquid volumn on the BPA degradation

圖6 接種量對雙酚A降解的影響Fig.6 The effect of inoculation rate on the BPA degradation

2.6 初始濃度對BPA降解的影響

圖7表明當培養(yǎng)體系中 BPA濃度從 150～600μg/kg，雙酚A降解率逐漸上升，到達65.76%，而從600～1200μg/kg的濃度范圍，雙酚A的降解率稍有上升，但趨勢平穩(wěn)。因此，600～1200μg/kg的雙酚A濃度為降解較優(yōu)濃度范圍，在此，選擇1000μg/kg進行下一步實驗。

圖7 初始濃度對雙酚A降解的影響Fig.7 The effect of initial concentration of BPA on the BPA degradation

2.7 溫度對BPA降解的影響

如圖8所示，在37℃下的雙酚A降解最好，達到69.60%，在35～37℃范圍內(nèi)，雙酚A的降解率差別較小，降解效果較好。隨著溫度的上升，雙酚A降解率直線下降，菌種的長勢也大幅下降。而溫度低于35℃，雙酚A的降解率也逐漸下滑，在25℃時，雙酚A的降解率只有12.81%。溫度的過高、過低都將直接影響菌株的生長情況，進而可能影響其產(chǎn)生雙酚A分解酶，從而影響雙酚A的降解效率。

圖8 培養(yǎng)溫度對雙酚A降解的影響Fig.8 The effect of culture temperature on the BPA degradation

2.8 最佳條件下菌種降解情況

選取上述最適宜條件，pH為 6.5，裝液量為100m L，接種量為0.1%，BPA初始濃度為1000μg/kg，37℃搖床(120 r/m in)培養(yǎng)32h，實驗結果如圖9所示。BPA隨著降解時間的延長，濃度不斷下降，在20～30h之間降解速率較快，在32h時，BPA降解率達到69.60%，32h以后BPA濃度稍有降低，但趨于緩慢。pH從初始值慢慢下降，在24h后基本達到平衡，維持在4.05左右。菌種OD值的變化與pH變化呈一定的相關性，在24h后達到平衡，維持在2.15左右。

圖9 最佳條件下羅伊式乳桿菌降解、生長曲線與pH變化圖Fig.9 Time－course degradation of BPA、growth curve of Lactobacillusreuteri and variation curve of pH under the best culture conditions

3 結論

本論文篩選得到可以降解雙酚A的高效菌株，分別是瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌。經(jīng)實驗優(yōu)化，羅伊式乳桿菌在雙酚 A濃度為600～1200μg/kg，pH為6～7，接種量為0.07～0.1%，裝液量為50～100m L，溫度為35～37℃時，雙酚A的降解效率較高。在最佳條件下，pH為6.5，裝液量為100m L，接種量為0.1%，BPA初始濃度為1000μg/kg時，37℃搖床(120r/min)培養(yǎng)32h后，降解率達到69.60%。

篩選出來的菌種降解能力較強，可以應用于包裝材料中雙酚A的降解，具有較好的實際應用前景。

［1］賀天鋒，陳奕.雙酚A生殖毒性研究進展［C］.華東地區(qū)第十次流行病學學術會議論文集.安徽:中華疾病控制雜志，2010:586－590.

［2］潭松.雙酚A與擠奶機安全性的討論［C］.首屆中國奶業(yè)大會論文集.北京:中國乳業(yè)，2010:392－395.

［3］王文枝，國偉，孫利，等.嬰兒奶瓶及食品包裝材料中雙酚A的風險評估［J］.食品科技，2008，33(1):197－199.

［4］成曉瑜.加拿大衛(wèi)生部:罐裝食品中不存在雙酚A風險［J］.農(nóng)業(yè)工程技術:農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)，2010，9:53－55.

［5］Lobos JH，Leib T K，Su T M.Biodegradation of bisphenol A and other bisphenols by a gram－negative aerobic bacterium［J］. Appl Environ Microbiol，1992，58(6):1823－1831.

［6］Kang J H，Katayama Y，and Kondo K.Biodegradation or metabolism of bisphenol A:from microorganisms tomammals［J］. Toxicology，2006，217:81－90.

［7］郭超，趙慧敏，全燮，等.白洋淀水中白腐真菌對雙酚A的降解規(guī)律及降解途徑［J］.環(huán)境污染和防治，2009，31(2): 4－13.

［8］Wang R，Dianjun Ren D，Siqing Xia S，et al.Photocatalytic degradation of Bisphenol A(BPA)using immobilized TiO2and UV illumination in a horizontal circulating bed photocatalytic reactor (HCBPR)［J］.Hazardous Materials，2009，169:926－932.

［9］王文增，趙文晉，黎娜，等.惡臭假單胞茵對沉積物中雙酚A的降解及產(chǎn)物分析［J］.安全與環(huán)境學報，2009，9(5): 70－73.

［10］Yamanaka H，Moriyoshi K，Ohmoto T，et al.Efficient microbial degradation of bisphenol A in the presence of activated carbon［J］.Bioscience and Bioengineering，2008，105(2): 157－160.

［11］龔清杰.固相萃?。咝б合嗌V法測定水源水中痕量雙酚A［J］.環(huán)?？萍?，2010，12(2):27－30.

Study on the degradation of bisphenol A by food bacteria

SHEN Li－jin，LIU Xin－jie，YAO Wei－rong*
(School of Food Science＆Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Six strained were screened which could degrade bisphenol A based on food－degrade strains.One of them，Lactobacillusreuteriwas selected for further study，and the effect of the culture conditions on the BPA degradation were studied.It showed that when the concentration of bisphenol A was 1000μg/kg，pH was 6.5，tem perature was 37℃，inoculation rate was 0.1%，the ratio of BPA degradation could reached 69.60%after 32h of culture.

b isphenol A;food－g rade bacteria;Lactobacillusreuteri;deg radation

TS201.3

A

1002－0306(2012)12－0210－04

2011－08－31 *通訊聯(lián)系人

沈麗金(1987－)，女，碩士在讀，研究方向:食品安全與質量控制。

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2009BADB9B04);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(JUSRP21124，30908，31005和31106)。