二氫苯駢［c］菲啶類生物堿的制備及其抗乙肝病毒的活性

吳穎瑞，方 宏，牙始康，何瑞杰

（1.中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所 廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541006；2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧530022）

二氫苯駢［c］菲啶類生物堿的制備及其抗乙肝病毒的活性

吳穎瑞1＊，方 宏1，牙始康2，何瑞杰1

（1.中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所 廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541006；2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧530022）

二氫苯駢［c］菲啶類生物堿是自然界中一類重要的生物活性成分，但含量很低.利用硼氫化還原方法，對(duì)博落回粗提物中的血根堿和白屈菜紅堿混合物進(jìn)行還原、分離，得到了二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿；并初步評(píng)價(jià)了其抗乙肝病毒活性.結(jié)果表明，利用硼氫化還原方法制備二氫苯駢［c］菲啶類生物堿的產(chǎn)率較高，還原產(chǎn)物具有一定的抗乙肝病毒活性.

二氫苯駢［c］菲啶類生物堿；二氫血根堿；二氫白屈菜紅堿；制備；抗乙肝病毒活性

苯駢［c］菲啶類生物堿是一類重要的天然有機(jī)物，其中完全芳香化苯駢［c］菲啶類生物堿是一個(gè)平面型的分子，分子中季銨離子的親電性使它能與反轉(zhuǎn)錄酶形成三維復(fù)合物，據(jù)推測(cè)，這是它關(guān)鍵的活性點(diǎn)位［1］.苯駢［c］菲啶類生物堿可以嵌入DNA，通過(guò)抑制DNA、RNA聚合酶的活性從而抑制蛋白質(zhì)的合成［2－3］.目前這一類型的化合物已有合成（如NK109）并作為抗癌藥物進(jìn)入了臨床研究.從植物中分離得到的二氫苯駢［c］菲啶類生物堿具有抗 HIV［4］，抗菌［5－6］、殺蟲(chóng)［7］、抗白血病［8］等活性，但是報(bào)道的文獻(xiàn)不多；另一方面，自然界中這類化合物含量低，通過(guò)分離這類化合物進(jìn)行活性研究，存在一定的困難，需要找到一個(gè)便捷、產(chǎn)量高的制備方法.

博落回為罌粟科植物Macleayacordata（Willd）R.B.，為我國(guó)廣泛分布的野生植物品種，其主要成分為血根堿（sanguinarine）和白屈菜紅堿（chelerythrine）等，這是完全芳香化的苯駢［c］菲啶生物堿，可以作為制備二氫苯駢［c］菲啶類生物堿的原料.另外，人們?cè)诤铣杀今墸踓］菲啶類生物堿時(shí)，也探討了這類化合物的還原方法［9］.作者通過(guò)使用硼氫化還原法，還原博落回提取物，制備了二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，并對(duì)還原產(chǎn)物進(jìn)行了抗乙肝病毒的活性實(shí)驗(yàn).血根堿、白屈菜紅堿及其還原產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.

圖1 血根堿、白屈菜紅堿及其還原產(chǎn)物Fig.1 Structures of sanguinarine，chelerythrine and their reduced products

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

XRC－1型熔點(diǎn)儀；VG Auto spec－3000，Bruker AM－400（400MHz／100MHz）核磁共振儀，TMS 為內(nèi)標(biāo).柱色譜硅膠（100～200、200～300目）、薄層色譜硅膠G和GF 254型硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品；改良碘化鉍鉀試劑為實(shí)驗(yàn)室自配，所用試劑均為分析純.乙肝表面抗原（HbsAg）和表面e抗原（HBeAg）檢測(cè)試劑盒為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品.

1.2 血根堿、白屈菜紅堿的提取

博落回植物采自廣西植物研究所后山，由廣西植物研究所分類學(xué)專家韋發(fā)南教授鑒定為罌粟科植物Macleayacordata（Willd.）R.B.取植物地上根莖5kg，陰干后粉碎，用0.5% 鹽酸8.0L溶液熱浸泡3次，每次3h.合并浸出液，用NH3·H2O調(diào)pH到10，攪勻，靜止48h后，過(guò)濾，沉淀于50℃烘干，得到灰色狀的生物堿粗品198g，，得率約為4%.

1.3 二氫血根堿、二氫白屈菜紅堿的制備與分離

在通風(fēng)柜里室溫條件下，取制備得到的博落回生物堿粗品50g，在甲酸中攪拌溶解，分少量多次加入約600g左右的硼氫化鈉，以TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程.反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)在室溫下攪拌30min，冷卻后的反應(yīng)混合物用10%的NaOH水溶液調(diào)pH到10左右，然后使用氯仿萃取，有機(jī)層用無(wú)水Na2SO4脫水后，減壓回收溶劑，得到灰色的膠狀物37g，收率為74%.

取還原產(chǎn)物10g，氯仿溶解后以適量的硅膠拌樣，使用硅膠為分離材料，減壓柱層析，使用石油醚／乙酸乙酯（體積比25∶1～5∶1）進(jìn)行梯度洗脫，分別得到化合物（1）1.2g，化合物（2）1.4g，得率分別為12%與14%.

化合物（1）.白色晶體（氯仿－甲醇），mp 169～171 ℃.［C20H16NO4］＋；FAB－MSm／z：334（［M］＋，100）.1H NMR（C5D5N，400MHz）δ：7.87（1H，d，J＝8.0Hz，H－11），7.85（1H，s，H－4），7.62（1H，d，J＝8.0Hz，H－12），7.45（1H，d，J＝8.0Hz，H－10），7.30（1H，s，H－1），6.98（1H，d，J＝8.0Hz，H－9），4.28（2H，s，H－6），6.06（2H，s，OCH2O－2，3），6.03（2H，s，OCH2O－7，8），2.56（3H，s，－NCH3）.13C NMR （C5D5N，100MHz）δ：104.8（C－1），148.8（C－2），148.2（C－3），101.1（C－4），127.0（C－14），142.9（C－15），48.7（C－6），113.9（C－17），145.2（C－7），147.8（C－8），107.7（C－9），116.8（C－10），124.9（C－18），127.5（C－16），120.9（C－11），124.5（C－12），131.5（C－13），41.5（NCH3），101.8（OCH2O－2，3），102.0（OCH2O－7，8）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，故鑒定化合物（1）為二氫血根堿.

化合物（2）.無(wú)色晶體（氯仿－甲醇），mp 169～171℃.［C21H20NO4］＋，F(xiàn)AB－MSm／z：350（100）.1HNMR （C5D5N，400MHz）δ：7.92（1H，d，J＝8.5Hz，H－11），7.89（1H，s，H－1），7.70（1H，d，J＝8.4Hz，H－10），7.65（1H，d，J＝8.5Hz，H－12），7.38（1H，s，H－4），7.05（1H，d，J＝8.4 Hz，H－9），6.06（2H，s，OCH2O－2，3），4.42（2H，s，H－6），3.86（3H，s，OCH3－8），3.78（3H，s，OCH3－7），2.60（3H，s，NCH3），2.64（1H，dd，J＝15.9，3.6Hz，H－1′a），2.38（1H，brm，H－1′b），2.07（3H，s，H－3′）.13C NMR（C5D5N，100MHz）δ：104.9（C－1），148.7（C－2），148.4（C－3），101.1（C－4），127.0（C－14），143.2（C－15），49.2（C－6），126.5（C－17），146.7（C－7），153.0（C－8），111.9（C－9），119.2（C－10），126.4（C－18），124.2（C－16），120.8（C－11），124.4（C－12），131.5（C－13），55.8（OCH3－7），60.9（OCH3－8），101.8（OCH2O－2，3），41.1（NCH3），46.6（C－1′），206.3（C－2′），30.2（C－3′）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］，故鑒定化合物（2）為二氫白屈菜紅堿.

1.4 二氫血根堿、二氫白屈菜紅堿的生物活性

藥物用DMSO溶解為母液，臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)液將母液稀釋，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 2.2.15細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后，加入不同濃度含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9d，以MTT法檢測(cè)，（1）和（2）均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性；HepG2 2.2.15細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后，加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9d（每3d換液一次），收集上清液，用HBsAg診斷試劑盒（ELISA）檢測(cè)HBsAg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.結(jié)果顯示，化合物二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿均有抑制HBV s抗原的作用.

表1 二氫血根堿、二氫白屈菜紅堿抗乙肝病毒的活性Table 1 Inhibitory activities of dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine against HBsAg and HBeAg secretions in Hep G2.2.15cell line

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)原料的制備

使用先分離后還原的方法，制備反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)程復(fù)雜，產(chǎn)率低［12］.博落回生物堿中的血根堿與白屈菜紅堿都屬于苯駢菲啶的衍生物，以季銨鹽的形式存在，結(jié)構(gòu)相似，極性大，使用一般的分離材料，難分離出單體化合物.文獻(xiàn)報(bào)道，反復(fù)使用重結(jié)晶和化學(xué)方法轉(zhuǎn)化，分離血根堿與白屈菜紅堿單體化合物，得率低于萬(wàn)分之一.使用先還原原料混合物后分離目標(biāo)產(chǎn)物的方法，產(chǎn)率大于0.3%.

2.2 還原方法的應(yīng)用

還原反應(yīng)常用的有金屬還原劑，如鋰，鈉、鋅和鐵粉等，在實(shí)驗(yàn)中也嘗試了使用鋅粉與鹽酸的還原方法，但是還原不完全，產(chǎn)率低.使用硼氫化鈉還原法，在室溫就可以完成，條件溫和，產(chǎn)率高，是制備二氫苯駢［c］菲啶類生物堿較理想的方法.

結(jié)論：使用硼氫化鈉還原的方法，對(duì)植物中完全芳香化的苯駢［c］菲啶生物堿進(jìn)行了還原，反應(yīng)產(chǎn)物容易分離，產(chǎn)率高，可以滿足活性實(shí)驗(yàn)的要求.另一方面，活性的研究結(jié)果表明，二氫苯駢［c］菲啶類生物堿具有抗乙肝病毒的活性，民間利用博落回治療肝炎，可能與這類生物堿有關(guān).

感謝復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院周珮教授在化合物活性測(cè)定方面給予的大力支持.

［1］KERRY M A，DUVAL O，WAIGH R D，et al.The role of the iminium bond in the inhibition of reverse transcriptase by quaternary benzophenanthridines［J］.J Pharm Pharmacol，1998，50（11）：1307－1315.

［2］TORRES C A，BáEZ A.Effects of the antitumor drugs 3－nitrobenzothiazolo［3，2－alpha］quinolinium and fagaronine on nucleic acid and protein synthesis［J］.Biochem Pharmac，1986，35（4）：679－685.

［3］SETHI V S.Inhibition of mammalian and oncornavirus nucleic acid polymerase activities by alkoxybenzophenanthridine alkaloids［J］.Cancer Res，1976，35：2390－2395.

［4］CHANG Y C，HSIEH P W，CHANG F R，et al.Two new protopines argemexicaines A and B and the anti－HIV alkaloid，6－acetonyldihydrocherythrine，from formosan argemone mexicana［J］.Planta Medica，2003，69（2）：148－152.

［5］TARUS P K，COOMBES P H，CROUCH N R，et al.Benzo［c］phenanthridine alkaloids from stem bark of the forest knobwood，zanthoxylum davyi（rutaceae）［J］.South Afric J Botany，2006，72（4）：555－558.

［6］SANCHEZ A E，HERNANDEZ M L R，SANCHEZ S J L，et al.Alkaloids from bocconia frutescens and biological activity of their extracts［J］.Pharmac Biolog，2006，44（7）：540－543.

［7］馮 崗，張 靜，馮俊濤，等.小果博落回中2種殺蟲(chóng)活性成分的分離及鑒定［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（1）：179－182.

［8］VRBA J，DOLEZEL P，VICAR J V，et al.Chelerythrine and dihydrochelerythrine induce G1phase arrest and bimodal cell death in human leukemia HL－60cells［J］.Toxicol Vitro，2008，22（4）：1008－1017.

［9］ISHII H，ISHIKAWA T，ICHIKAWA Y，et al.Studies on the chemical constituents of rutaceous plants.LV.The development of a versatile method for the synthesis of antitumor－active benzo［c］phenanthridine alkaloids.（5）.A new method for quaternization of the benzo［c］phenanthridine nucleus［J］.Chem Pharmac Bull，1984，32（8）：2984－2994.

［10］HALBSGUTH C，MEISSNER O，H?BERLEIN H，Positive cooperation of protoberberine type 2alkaloids from corydalis cava on the GABAA binding site［J］.Planta Medica，2003，69：305－309.

［11］OECHSLIN S M K，OECHSLIN M K，WRIGHT A D，et al.An NMR study of four benzophenanthridine alkaloids［J］.J Nat Prod，1991，54：519－524.

［12］胡之璧，徐 垠，馮勝初，等，博落回果實(shí)中有效成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1979，14（9）：535－540.

Preparation of dihydrobenzo［c］phenanthridine alkaloids and evaluation of their anti－h(huán)epatitis B virus activity

WU Yingrui ，F(xiàn)ANG Hong，YA Shikang，HE Ruijie
（1.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemical Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Guilin541006，Guangxi，China； 2.Guangxi Institute of Chinese Medicine ＆Pharmaceutical Science，Nanning530022，Guangxi，China）

Dihydro－benzo［c］phenanthridine alkaloids are a kind of bioactive constituents，but their contents are very low in natural plants.Thus the mixture of sanguinarine and chelerythrine primarily extracted from Macleaya cordata （Willd）R B were reduced by sodium borohydride and separated into dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine.The anti－h(huán)epatitis B virus（HBV）activity of as－obtained dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine was evaluated.It has been found that phenanthridine alkaloids can be obtained in a high yield viathe reduction of sanguinarine and chelerythrine by borohydride.As－obtained dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine products have some inhibitory effect against HBV（HBsAg secretions in Hep G2.2.15cell line）.

dihydro－benzo［c］phenanthridine alkaloids；dihydrosanguinarine；dihydrochelerythrine；preparation；anti－HBV activity

O 063.2

A

1008－1011（2012）04－0056－04

2011－12－25.

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（0832021）.

吳穎瑞（1966－），男，副研究員，博士，主要從事抗病毒、抗菌的植物活性成分研究.E－mail：wyrui＠yanhoo.com.