乳兔竇房結(jié)細胞的分離及鑒定

劉如秀，劉宇，汪艷麗，彭杰，徐利亞

竇房結(jié)（sinoatrial node，SAN）是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中的重要組成部分，為心臟的正常起搏點，SAN病變可導(dǎo)致各種類型的心律失常。為了從細胞水平深入研究竇房結(jié)細胞（sinus node cell，SNC）的形態(tài)特征及電生理特性，本實驗對乳兔竇房結(jié)細胞的分離、純化、培養(yǎng)與鑒定方法進行了研究。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；膠原酶Ⅱ型（Sigma公司）；5-溴脫氧尿核苷（5-BrdU，美國Sigma公司）；24小時內(nèi)的新西蘭乳兔，雌雄不限；動作電位的電極液。電極內(nèi)液：K-Aspartate 120mmol/L、 MgCl25mmol/L、HEPES 10mmol/L、KCl 20mmol/L、Na2ATP 5mmol/L，以KOH調(diào)pH至7.2。細胞外液：NaCl 140mmol/L、KCl 5.4mmol/L、CaCl21.8mmol/L、MgCl20.5mmol/L、NaH2PO40.33mmol/L、Glucose 5.5mmol/L、HEPES 5mmol/L，以NaOH調(diào)PH至7.4。

MultiClamp膜片鉗放大器（美國Axon公司）；IX51倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；玻璃微電極拉制儀P-97（美國Sutter公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳兔竇房結(jié)細胞的分離與培養(yǎng) 出生24h內(nèi)的新西蘭乳兔5只，消毒后仰臥位固定于無菌泡沫上，剪開胸前壁，暴露心臟，在解剖顯微鏡下分離心包膜，于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部取2mm×2mm×2mm的組織塊于DMEM中，吹打5次后置于PBS液中用眼科彎剪剪成0.3mm×0.3mm×0.3mm的小塊，吸棄上清。然后加入0.08%的胰酶8ml于37℃水浴中震蕩5min，吹打1min，沉淀后吸棄上清液。再次加入0.025%Ⅱ型膠原酶8ml于37℃水浴中震蕩10min，沉淀后吸取上清液于50ml離心管中，離心管中加入20ml 15%FBS的DMEM培養(yǎng)基；再進行2次消化。用400目金屬濾網(wǎng)，940r/min離心7min。離心后倒掉上清，加入培養(yǎng)液，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/L，將單細胞懸液接種于60mm的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育90 min，差速貼壁以除去成纖維細胞。24h后細胞換液，此后隔天換液，每次換液均加入0.1 mmol/L 5- BrdU。在膜片鉗放大器的全細胞模式下[1]，以電流鉗方式記錄培養(yǎng)竇房結(jié)細胞的動作電位。

1.2.2 細胞的形態(tài)學(xué)鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并以手按計數(shù)器計數(shù)細胞收縮頻率，蘇木精-伊紅染色，置于光鏡下觀察。

1.2.3 培養(yǎng)細胞的電生理學(xué)鑒定 在膜片鉗放大器的全細胞模式下，以電流鉗方式記錄竇房結(jié)細胞的動作電位。放大器為Axon200B, 以Pclamp軟件包采集、分析數(shù)據(jù)。實驗記錄過程中竇房結(jié)細胞外液持續(xù)通入低流量氧。濾波頻率2kHz，溫度控制在（35±1）℃。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有計量資料采用（）表示。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察 差速貼壁前，接種細胞為清亮的圓形或桿狀，30 min 后有細胞開始貼壁生長，大部分呈小的梭形，20h可見有細胞搏動，頻率不一。2d后細胞開始出現(xiàn)3～4個長短不一的觸角突起，5d 后細胞主要呈3 種形態(tài)：梭形、蜘蛛形與多邊形。梭形細胞（圖1、2）數(shù)目最多占比（61.5±6.8）%，搏動頻率快，（136±12）次/min；蜘蛛形細胞胞體較大，多伸有偽足，搏動頻率較梭形細胞慢（106±9）次/ min（圖3）；少量多邊形細胞體積較大、少偽足且無搏動，細胞平坦、胞漿清亮（圖4）。

2.2 竇房結(jié)細胞的電生理特征 用電流鉗技術(shù)通過全細胞記錄模式檢測竇房結(jié)細胞中梭形細胞的動作電位，其動作電位有舒張期自動除極化（圖5）。先后記錄了10個梭形細胞的動作電位，其平均最大舒張電位為（-50.9±5.3）mV，動作電位幅度為（61.9±4.8）mV。

3 討論

準確定位乳兔竇房結(jié)的部位并取材是培養(yǎng)竇房結(jié)細胞的關(guān)鍵，直接影響著培養(yǎng)細胞中竇房結(jié)細胞所占的比例。本實驗參考鐘理等[2]的培養(yǎng)方法，在解剖顯微鏡下于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部進行取材。實驗結(jié)果顯示梭形細胞所占比例為60%左右，表明該取材方法較為可靠。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，消化酶的種類及消化時間對細胞的數(shù)量至關(guān)重要，前期研究只采用0.08%胰酶消化5min左右，發(fā)現(xiàn)乳兔成纖維細胞數(shù)量較少，培養(yǎng)的竇房結(jié)細胞更少。后對實驗加以改進，采用0.08%胰酶和0.025%Ⅱ型膠原酶進行消化，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞和竇房結(jié)細胞成長均佳，證明此方法培養(yǎng)細胞可靠。在竇房結(jié)細胞培養(yǎng)與純化過程中，成纖維細胞生長速度較SNC快，影響竇房結(jié)細胞培養(yǎng)的純化。但成纖維細胞貼壁速度較快，而SNC在短時間內(nèi)不會貼壁或者貼壁不緊，稍加晃蕩即浮起，可通過差速貼壁以純化細胞。若在培養(yǎng)液中加入5-BrdU則可抑制成纖維細胞生長而對SNC無影響的目的。通過此法梭形細胞所占的比例較常規(guī)培養(yǎng)方法有明顯的提高。通過該方法得到的SNC分散好、活性高、表面潔凈，適用于膜片鉗技術(shù)。

圖1 竇房結(jié)細胞×20

圖2 竇房結(jié)細胞×10

圖3 蜘蛛形細胞

圖4 多邊形細胞

圖5 SNC動作電位

竇房結(jié)組織學(xué)提示SNC呈梭形，漿內(nèi)有少量散亂的肌微絲，無完整的肌節(jié)和明顯Z線，胞核中等大小呈圓形，位于胞體中央，胞漿染色較淺，線粒體少。本研究中光鏡和投射電鏡觀察到的梭形細胞的形態(tài)與其十分相似。膜片鉗實驗也發(fā)現(xiàn)梭形細胞動作電位的特性與分離的竇房結(jié)單細胞的特性相似，證實了本實驗中的梭形細胞就是竇房結(jié)起搏細胞。通過綜合應(yīng)用雙胰酶逐次消化結(jié)合差速貼壁及5-BrdU純化處理進行乳兔竇房結(jié)細胞的原代培養(yǎng)，是可靠的培養(yǎng)方法，多次重復(fù)試驗證明顯著提高了SNC分離的數(shù)量和純度，為SNC的研究提供了實驗基礎(chǔ)。

[1]Han X,Light PE,RilesW,et al. Identification and propertiesof an ATP-sensitive K+current in rabbit sinoatrial node pacemaker cells[J]. J Physiol,1996,490(Pt2):337-350.

[2]鐘理,宋治遠. 原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞的形態(tài)學(xué)研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2002,24(2):431-3.