不同濃度超順磁性氧化鐵納米粒子對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響

韓莎莎，李俊峽

越來越多的研究表明，急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）的發(fā)生與動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，斑塊脂質(zhì)中心越大，纖維帽中的炎細(xì)胞（主要是巨噬細(xì)胞）越多，斑塊越不穩(wěn)定，越容易破裂而導(dǎo)致ACS的發(fā)生[1,2]。超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）作為一種磁共振對(duì)比劑，能被血液中的吞噬細(xì)胞特異性吞噬而標(biāo)記吞噬細(xì)胞，標(biāo)記后的吞噬細(xì)胞可以游走到炎癥所在部位并聚集，在磁共振掃描時(shí)，造成炎癥所在部位的T2弛豫時(shí)間縮短，信號(hào)減低。因此可采用SPIO增強(qiáng)磁共振顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)早期診斷及評(píng)估AS斑塊的穩(wěn)定性。隨著SPIO濃度的升高，巨噬細(xì)胞的標(biāo)記率提高，但是高濃度的SPIO對(duì)巨噬細(xì)胞有毒性作用。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的SPIO標(biāo)記小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率、細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞吞噬功能來評(píng)價(jià)SPIO標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞的最適濃度。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶/EDTA混合液為Hyclone產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為Gibcol產(chǎn)品；超順磁性氧化鐵（SHU555）（商品名Resovest）為德國(guó)Sehering公司產(chǎn)品，為荷蘭鹿特丹Erasmus大學(xué)醫(yī)學(xué)中心放射線科張卓立博士后提供；二甲基亞砜（DMSO）為Sigma產(chǎn)品；四唑鹽（MTT）為Biosharp公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Hereaus公司產(chǎn)品；CA950-2型超凈臺(tái)為上海凈化儀器廠生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃，5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，當(dāng)RAW264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右融合時(shí)，0.25%胰酶加EDTA混合液消化細(xì)胞，5min左右加入FBS終止消化，再加入DMEM培養(yǎng)基8ml左右，吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按1:1傳代。

1.2.2 SPIO標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞 將RAW264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔2.5×105cells接種于內(nèi)置蓋玻片的6孔板中，加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，依次向各孔中加入含有SPIO的鐵濃度為14 μg/ml、28 μg/ml、56 μg/ml、84 μg/ml的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，另設(shè)1未加SPIO的樣品孔作為空白對(duì)照。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察SPIO在細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記率，每個(gè)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)2個(gè)視野，每個(gè)視野至少100個(gè)細(xì)胞。再將SPIO濃度擴(kuò)大10倍（即140 μg/ml、280 μg/ml、560 μg/ml、840 μg/ml）重復(fù)上述步驟。

將式(3)、(9)代入式(10)、(11)可得空間光到少模光纖耦合效率隨橫向偏移rb的變化曲線.由于兩模光纖的模場(chǎng)面積較單模光纖大，且支持三個(gè)模式的模場(chǎng)傳輸，當(dāng)聚焦光斑發(fā)生橫向偏移時(shí)，兩模光纖的LP11a模和LP11b模也會(huì)接收到信號(hào)光，少模光纖接收到的光能量要高于單模光纖，能夠獲得更高的耦合效率，因此少模光纖對(duì)光斑橫向偏移的容忍度更高.

1.2.5 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞以每孔104的相同細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉舊培養(yǎng)基，以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h，PBS洗滌3次，每孔加入0.7%的中性紅溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)3h，棄去中性紅，PBS洗滌3次，吸干，加入細(xì)胞裂解液（冰醋酸：無水乙醇=1:1）150 μl，4℃過夜，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光光度值。

2.2 細(xì)胞活性

鬼算盤錢通，年約四十，暗紫色長(zhǎng)衫，外罩藏青色馬褂，清瘦，一副大眾面孔，那怕你和他多次見面也不會(huì)留下絲毫印象；

(4)缺乏培養(yǎng)新型人才的實(shí)踐環(huán)境。新時(shí)期新型人才的培養(yǎng)更加重視理論與實(shí)踐的結(jié)合，對(duì)于實(shí)踐環(huán)境的要求也更高。當(dāng)前，很多高校的理論課程內(nèi)實(shí)驗(yàn)或設(shè)計(jì)在計(jì)算機(jī)機(jī)房或者實(shí)驗(yàn)室就可以很好地完成。但是，這些實(shí)踐環(huán)境不能滿足企業(yè)的要求，需要和企業(yè)進(jìn)行更為緊密的合作。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)：消化收集常規(guī)培養(yǎng)的未標(biāo)記及含有SPIO的RAW264.7細(xì)胞懸液，并稀釋至106個(gè)/ml，取9滴細(xì)胞懸液移入小試管內(nèi)，加入1滴0.4%的臺(tái)盼藍(lán)，混勻，3分鐘內(nèi)在光鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中死細(xì)胞染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量?；罴?xì)胞率=（100-藍(lán)染細(xì)胞/100）×100%的公式計(jì)算活細(xì)胞百分率，重復(fù)測(cè)量3次。

選取2018年1—10月在我院接受治療的60例急性單純性闌尾炎患者作為研究對(duì)象，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組各30例。觀察組中，男17例，女13例；年齡12～79歲，平均年齡（34.86±3.92）歲；病程1～10 h，平均病程（4.06±1.33）h。對(duì)照組中，男16例，女14例；年齡19～75歲，平均年齡（35.08±3.14）歲；病程1～10 h，平均病程（4.12±1.27）h。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2 結(jié)果

2.1 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 普魯士藍(lán)染色證實(shí)RAW264.7細(xì)胞漿內(nèi)有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒，大部分的鐵聚合物包繞在細(xì)胞核周圍，而細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞外則未檢測(cè)到（圖1）。SPIO的鐵濃度為84μg時(shí)，標(biāo)記24小時(shí)細(xì)胞的標(biāo)記率達(dá)到100%（圖1b），以后隨SPIO濃度的增加細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加，普魯士藍(lán)染色的顏色越來越深（圖1c～圖1f），而普魯士藍(lán)染色的色澤是由吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)鐵的含量所決定的。到280μg/ml時(shí)，細(xì)胞吞噬鐵含量接近飽和，以后隨SPIO濃度增加，細(xì)胞內(nèi)鐵含量沒有增加，普魯士藍(lán)染色未見加深。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 四唑鹽（MTT）比色實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以每孔103的相同細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每一時(shí)相每一組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24h后更換培養(yǎng)液，以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h，PBS沖洗，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，選擇490nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度值（OD）。此后7天每天監(jiān)測(cè)并記錄細(xì)胞OD值，觀察細(xì)胞對(duì)不同標(biāo)記濃度的反應(yīng)。

術(shù)后疼痛程度評(píng)分比較,觀察組VAS評(píng)分結(jié)果(3.05±1.00)分,與對(duì)照組評(píng)分結(jié)果(5.50±1.50)分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞被染成藍(lán)色而活細(xì)胞拒染（圖2），提示SPIO濃度對(duì)細(xì)胞活性有影響，進(jìn)一步行SNK多重比較檢驗(yàn)示SPIO濃度為560μg /ml和840μg /ml的兩組與其他組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表1）。

2.2.2 四唑鹽（MTT）比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)MTT比色實(shí)驗(yàn)所得OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3），當(dāng)SPIO含鐵濃度大于等于280μg /ml時(shí)細(xì)胞增殖受影響，與對(duì)照組及SPIO含鐵濃度小于280μg/ml各組生長(zhǎng)曲線相比差異較大，而對(duì)照組生長(zhǎng)曲線與SPIO含鐵濃度小于280μg /ml各組生長(zhǎng)曲線相比未見明顯差異。說明SPIO含鐵濃度大于140μg/ml時(shí)抑制RAW264.7細(xì)胞增殖。

2.3 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞核周圍及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見巨噬細(xì)胞吞噬的中性紅顆粒（圖4a），將中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)所得OD值繪成折線圖（圖4b），可見SPIO含鐵濃度小于等于280μg /ml時(shí)，SPIO濃度與OD值成正比，當(dāng)SPIO濃度超過280μg/ml后OD值與SPIO濃度呈反比，說明SPIO含鐵濃度＞280μg/ml時(shí)，巨噬細(xì)胞的吞噬功能受到影響。

3 討論

圖1 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 （SPIO的鐵濃度依次為：1a：28μg /ml，1b：84μg，1c：140μg /ml，1d：280μg /ml，1e：560μg /ml，1f：840μg /ml）

表1 不同SPIO濃度下活細(xì)胞數(shù)

圖2 細(xì)胞活性檢測(cè)（臺(tái)盼藍(lán)染色，箭頭所指處為藍(lán)染死細(xì)胞）

圖3 MTT法檢測(cè)不同SPIO濃度標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

全球范圍內(nèi)心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，其中動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。穩(wěn)定性的動(dòng)脈粥樣硬化主要以血管腔狹窄而造成的各種缺血癥狀為主，而易損斑塊則由于斑塊破裂、血栓形成而產(chǎn)生如心肌梗死、腦血管梗死等急性事件。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮損傷所做出的一系列慢性炎癥反應(yīng)，其中巨噬細(xì)胞貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的全過程，與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[3-5]。

圖4 吞噬功能檢測(cè)（4a：中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4b：細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)OD值曲線）

馬占龍[5]等的研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細(xì)胞吞噬SPIO使大量納米鐵顆粒在斑塊局部聚集，進(jìn)而引起了MRI信號(hào)的改變，從而可實(shí)現(xiàn)粥樣斑塊活體檢測(cè)。Raynal等[6]實(shí)驗(yàn)表明，SPIO可通過巨噬細(xì)胞的“清道夫”受體（scavenger recep tors SR2A）被吞噬，而很少被內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞攝取[7-9]。這些研究提示通過巨噬細(xì)胞吞噬SPIO在磁共振下顯影可實(shí)現(xiàn)在體無創(chuàng)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)富含巨噬細(xì)胞的易損斑塊的病變發(fā)展，指導(dǎo)臨床治療及預(yù)防工作。但需要尋找合適的SPIO濃度，SPIO濃度過高會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用影響細(xì)胞功能及活性，SPIO過低則不能清晰顯影粥樣硬化斑塊。本實(shí)驗(yàn)主要通過不同濃度SPIO體外標(biāo)記RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞活性和標(biāo)記率的影響評(píng)估了體外標(biāo)記巨噬細(xì)胞的最適濃度。發(fā)現(xiàn)SPIO含鐵濃度84μg/ml即可達(dá)到巨噬細(xì)胞100%標(biāo)記，140μg/ml以下不影響細(xì)胞增殖，280μg/ml以下不影響細(xì)胞吞噬功能。對(duì)日后進(jìn)一步體內(nèi)及體外研究SPIO對(duì)巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

但是，本研究?jī)H從細(xì)胞活性和吞噬能力兩方面評(píng)價(jià)了不同濃度SPIO對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響，沒有對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行磁共振顯影，無法比較不同濃度SPIO標(biāo)記的RAW264.7細(xì)胞在磁共振下顯影的效果，也沒有通過電子顯微鏡觀察對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。

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