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    Faecalibacterium prausnitzii對實驗性結(jié)腸炎大鼠Foxp3+Treg細胞的影響

    2012-10-22 12:10:28楊曉彤張明明邱新運于成功
    胃腸病學(xué) 2012年3期

    楊曉彤 張明明 洪 娜 邱新運 于成功*

    南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因不明的炎癥性腸病,目前主要認為該病與免疫、遺傳、環(huán)境和感染等多種因素有關(guān)。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)是一組能抑制其他免疫細胞活化、增殖的細胞亞群,F(xiàn)oxp3作為X染色體編碼的叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是Treg細胞發(fā)育、分化和功能發(fā)揮必不可少的調(diào)節(jié)因素[1]。益生菌在UC發(fā)病和治療過程中的作用越來越受到重視。Mazmanian等[2]的研究發(fā)現(xiàn)一種腸道共生菌脆弱類桿菌(B.fragilis)對實驗性結(jié)腸炎動物模型有一定的抗炎作用,這種作用是通過細菌產(chǎn)物多糖 A(PSA)來實現(xiàn)的。Faecalibacterium prausnitzii(FP)是存在于正常人腸道內(nèi)的共生菌,與正常人相比,UC患者糞便中FP數(shù)量明顯減少[3]。本實驗通過建立2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎大鼠模型,并研究FP對TNBS結(jié)腸炎的治療作用,旨在初步探討其治療機制。

    材料與方法

    一、實驗動物、細菌、主要試劑和儀器

    SPF級 Sprague-Dawley(SD)大鼠 60只,體質(zhì)量160~200 g,雌雄各半,由南京大學(xué)附屬南京鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供。

    FP(ATCC 27766)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)由上海信誼藥廠有限公司饋贈。TNBS購自美國Sigma公司;大鼠白細胞介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自eBioscience公司;大鼠IL-12 ELISA試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE和固定破膜液購自 eBioscience公司;淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司。流式細胞儀(BD公司);酶聯(lián)免疫分析儀(2550型)購自日本Bio-Rad公司。

    二、方法

    1.實驗分組與造模方法:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,稱重編號后隨機分為正常對照組、結(jié)腸炎組、FP組、FP上清液組、培養(yǎng)基組和雙歧桿菌組,每組各10只。后5組大鼠禁食不禁水24 h,制備結(jié)腸炎模型。采用乙醚麻醉后,將直徑約0.2~0.3 cm的橡膠軟管插入大鼠結(jié)腸距肛門8~10 cm處,以TNBS 80 mg/kg+等體積無水乙醇混合液緩慢推入結(jié)腸,將大鼠肛門向上傾斜45°,放置1 min,然后保持平躺狀態(tài),自然清醒。正常對照組以0.9%NaCl溶液80 mg/kg+等體積無水乙醇混合液灌腸作為對照,其余過程均相同。

    2.干預(yù)方法:將生長24 h的細菌培養(yǎng)基混合液離心,菌體以PBS洗滌2次后懸于PBS溶液中,密度調(diào)整至109/ml。上清液凍干成粉狀,以PBS溶解,濃度為原上清液的5倍。造模成功24 h后,正常對照組、結(jié)腸炎組大鼠每日1 mL PBS灌胃,F(xiàn)P組、雙歧桿菌組分別以1 mL FP細菌懸液和長雙歧桿菌懸液灌胃,F(xiàn)P上清液組、培養(yǎng)基組分別以1 mL FP上清液和FP培養(yǎng)基灌胃,連續(xù)7 d。處死大鼠后取距肛門6 cm處結(jié)腸組織行病理切片,并取外周血和脾臟。

    3.結(jié)腸炎組織病理學(xué)評估:大鼠結(jié)腸組織以4%多聚甲醛溶液固定24 h,脫水、透明、浸蠟后進行組織包埋,切片后行HE染色,鏡下觀察。參照Neurath等[4]的研究,行病理學(xué)評分:0分為無炎癥;1分為很少量粒細胞浸潤;2分為少量炎性細胞浸潤;3分為大量炎性細胞浸潤,血管增多,結(jié)腸壁增厚;4分為透壁性炎癥,杯狀細胞減少,血管增多和結(jié)腸壁增厚。

    4.外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例的檢測:取大鼠腹主動脈血2 mL,以肝素抗凝,按淋巴細胞分離液說明書分離全血淋巴細胞。摘取大鼠脾臟后去外膜,切成0.5 cm×0.5 cm的小塊,用200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨。將全血淋巴細胞和脾臟細胞溶于流式染色緩沖液后,將細胞數(shù)調(diào)至106/管,分別加入 CD4-FITC1.0 μg 和 CD25-APC 0.4 μg 單克隆抗體,4℃避光孵育1 h;清洗離心后,固定/透化工作液4℃避光孵育50 min穿孔;加入Foxp3-PE 1.0 μg,4 ℃避光孵育 1 h,清洗 2 遍后,上流式細胞儀檢測。

    5.外周血細胞因子的檢測:大鼠腹主動脈取血2 mL,以肝素抗凝,離心取上清,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-10、IL-12和TGF-β含量。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、一般情況

    正常對照組大鼠因麻醉意外死亡1只;培養(yǎng)基組大鼠因嚴重腸梗阻死亡2只;雙歧桿菌組因麻醉意外死亡1只,嚴重腸梗阻死亡1只,斗毆致外傷死亡1只。

    造模后第2 d,結(jié)腸炎組大鼠開始出現(xiàn)腹瀉,為黃色稀便、半稀便甚至血便;大鼠毛色失去光澤,進食和活動明顯減少,體質(zhì)量明顯下降,反應(yīng)遲鈍。給予干預(yù)7 d后,F(xiàn)P組、FP上清液組和雙歧桿菌組大鼠腹瀉好轉(zhuǎn),大便轉(zhuǎn)為黃色,稍稀或干便,精神逐漸恢復(fù)正常,毛色恢復(fù)光澤,進食和活動逐漸增多。正常對照組和培養(yǎng)基組大鼠無上述各種變化。

    二、結(jié)腸大體形態(tài)和組織病理改變

    正常對照組和培養(yǎng)基組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整,無充血水腫,黏膜下血管正常,腺體排列整齊;結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸黏膜不同程度充血、水腫,有潰瘍形成,以結(jié)腸下段明顯,鏡下可見大量炎性細胞浸潤,黏膜和黏膜下層血管擴張、增多,腺體結(jié)構(gòu)紊亂;FP組、FP上清液組和雙歧桿菌組可見少量炎性細胞浸潤,黏膜稍有充血、水腫,血管增生不明顯,其中FP上清液組療效更為明顯(見圖1)。

    與正常對照組相比,結(jié)腸炎組病理學(xué)評分顯著升高(P<0.01)。與結(jié)腸炎組相比,F(xiàn)P組、FP上清液組和雙歧桿菌組病理學(xué)評分顯著下降(P<0.05),而FP組和FP上清液組與雙歧桿菌相比無明顯差異(見表 1)。

    表1 各組大鼠組織病理學(xué)評分以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例比較()

    表1 各組大鼠組織病理學(xué)評分以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例比較()

    與正常對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與結(jié)腸炎組比較,*P<0.05,**P<0.01;#與培養(yǎng)基組比較,P<0.05

    三、外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例

    與正常對照組相比,結(jié)腸炎組大鼠外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著降低(P<0.05);經(jīng)FP和FP上清液治療后,其比例顯著增高(P<0.05),而雙歧桿菌與結(jié)腸炎組相比無明顯差異;FP上清液組外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例明顯高于培養(yǎng)基組(P<0.05)(見表1)。

    四、血漿 IL-10、IL-12 和 TGF-β 含量

    與正常對照組相比,結(jié)腸炎組大鼠血漿IL-10和TGF-β含量顯著降低(P<0.05),IL-12含量顯著升高(P<0.01),IL-10/IL-12 比值顯著降低(P<0.01);經(jīng)FP、FP上清液和雙歧桿菌治療后,IL-10含量有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,IL-12含量明顯下降(P<0.05),IL-10/IL-12 比值顯著升高(P<0.01),TGF-β 含量顯著增高(P<0.05);FP上清液組 IL-10/IL-12比值和TGF-β含量均顯著高于培養(yǎng)基組(P<0.05)(見表 2)。

    討 論

    UC是一種病因未明的腸道非特異性炎性疾病,機體對包括腸道微生物在內(nèi)的各種因素產(chǎn)生了異常免疫反應(yīng)。人體消化道寄生著大量細菌,在機體免疫系統(tǒng)正常的情況下,這些細菌與腸道黏膜之間維持免疫平衡和耐受。如某種因素導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),即會打破這種平衡,導(dǎo)致腸道黏膜受損,從而引發(fā)腸道炎癥。腸黏膜上皮細胞和免疫細胞通過Toll樣受體和NOD樣受體特異性識別細菌的分子配體,而這種相互作用能調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)[5]。Kruis等[6]的研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Nissle 1917對UC維持緩解的療效及其安全性與金標準的美沙拉秦相似;另一項隨機雙盲對照試驗[7]顯示,長雙歧桿菌與益生元(Synergy 1)的產(chǎn)物合生元可改善18例急性UC患者的癥狀和炎癥反應(yīng),說明益生菌在抑制UC炎癥方面起有重要的作用。

    腸道黏膜免疫-炎癥反應(yīng)異常在UC發(fā)病中起有重要作用,T細胞是參與這一過程的主要免疫細胞,通過TCR介導(dǎo)識別抗原、活化后,發(fā)揮細胞毒作用或通過分泌細胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。與Th1細胞和Th2細胞不同,Treg細胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群,在多種免疫性疾病中起重要作用,雖然其具體的細胞分子通路尚不清楚,但越來越來多的證據(jù)表明Treg細胞能通過多種機制來抑制免疫應(yīng)答。體外實驗證明Treg細胞能抑制其他T細胞的活性,其機制可能是直接通過細胞間的接觸依賴,或通過間接調(diào)節(jié)抗原呈遞細胞的活性[8,9]。目前發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)Treg細胞也能抑制固有免疫反應(yīng),但能否抑制非T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)尚不清楚。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞的特異性標記物,是發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。Brunkow等[10]首先在Scurfy小鼠中證實了Foxp3基因更多表達于CD4+T細胞中;Foxp3是fox蛋白家族成員之一,在CD4+CD25+Treg細胞發(fā)育和功能發(fā)揮中起重要作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)oxp3基因突變或敲除的小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量明顯下降,并伴有調(diào)節(jié)功能缺陷,可誘發(fā)嚴重的自身免疫反應(yīng),因此,F(xiàn)oxp3對機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[12]。

    動物實驗[13]證實細胞因子如IL-10和TGF-β在Treg細胞發(fā)揮抑制腸道炎癥的功能中起重要作用。這些分子能對T細胞和其他固有免疫細胞起多種抑制效應(yīng)。IL-10是體內(nèi)重要的抑炎因子,能抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α 的分泌,上調(diào) IL-1RA/IL-β 比值,影響干擾素(IFN)-γ的產(chǎn)生。IL-10基因缺失小鼠會發(fā)生以促炎細胞因子分泌紊亂為特征的自發(fā)性腸道炎癥[14]。IL-12是細胞免疫中的重要因子,能通過促進T細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)的產(chǎn)生而增加IFN-γ、IL-2、IL-8的生成,從而抑制Th2細胞并促進Th1細胞的作用。IL-10/IL-12比值常用于衡量抑炎效應(yīng)。

    本實驗中通過給予結(jié)腸炎模型大鼠FP及其上清液干預(yù)治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸道炎癥病理改變明顯緩解,糜爛、水腫、炎性細胞浸潤等明顯減輕;同時外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例和血漿TGF-β含量明顯提高,IL-10含量雖無明顯差異,但呈升高趨勢,IL-12含量明顯降低,IL-10/IL-12比值明顯升高。FP及其上清液治療結(jié)腸炎可能的原因為:①FP及其上清液能調(diào)節(jié)免疫功能,通過增加Foxp3的表達,改善腸道免疫狀態(tài),減輕腸道局部炎癥反應(yīng),使紊亂的腸道免疫系統(tǒng)恢復(fù);②FP及其上清液可增加外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例,使其對全身免疫系統(tǒng)構(gòu)成良性循環(huán),有利于整個機體免疫功能的恢復(fù);③TGF-β含量增加,使原始T細胞更多的向Treg細胞方向轉(zhuǎn)化,從而扭轉(zhuǎn)T細胞亞群的不平衡,而IL-10能通過旁分泌的形式維持Treg細胞Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的表達。

    表2 各組大鼠血漿IL-10、IL-12、TGF-β 含量比較()

    表2 各組大鼠血漿IL-10、IL-12、TGF-β 含量比較()

    與正常對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與結(jié)腸炎組比較,*P<0.05,**P<0.01;#與培養(yǎng)基組比較,P<0.05

    總之,本實驗通過給予實驗性結(jié)腸炎模型大鼠補充FP及其上清液,發(fā)現(xiàn)其可通過增加Foxp3的表達而提高外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例,從而對UC發(fā)揮一定的治療效果,但其更具體的作用組分以及機制尚有待今后研究進一步探討證實。

    1 孔珍珍,李付廣.Foxp3在CD25+CD4+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)育和功能中作用的研究進展[J].國際免疫學(xué)雜志,2010,33(3):205-208.

    2 Mazmanian SK,Round JL,Kasper DL.A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease[J].Nature,2008,453(7195):620-625.

    3 Sokol H,Seksik P,Furet JP,et al.Low counts of Faecalibacterium prausnitziiin colitismicrobiota[J].Inflamm Bowel Dis,2009,15(8):1183-1189.

    4 Neurath MF,Fuss I,Kelsall BL,et al.Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice[J].J Exp Med,1995,182(5):1281-1290.

    5 Marteau P,Sokol H,Dray X,et al.Bacteriotherapy for inflammatory boweldisease:therapeutic tooland/or pharmacological vectors[J]?Gastroenterol Clin Biol,2009,33 Suppl 3:S228-S234.

    6 Kruis W,Fric P,Pokrotnieks J,et al.Maintaining remission of ulcerative colitis with the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is as effective as with standard mesalazine[J].Gut,2004,53(11):1617-1623.

    7 Furrie E,Macfarlane S,Kennedy A,et al.Synbiotic therapy (Bifidobacterium longum/Synergy 1)initiates resolution ofinflammation in patients with active ulcerative colitis:a randomised controlled pilot trial[J].Gut,2005,54(2):242-249.

    8 Vendetti S,Chai JG,Dyson J,et al.Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells[J].J Immunol,2000,165(3):1175-1181.

    9 Cederbom L,Hall H,Ivars F.CD4+CD25+regulatory T cells down-regulate co-stimulatory molecules on antigenpresenting cells[J].Eur J Immunol,2000,30(6):1538-1543.

    10 Brunkow ME,Jeffery EW,Hjerrild KA,et al.Disruption of a new forkhead/winged-helix protein,scurfin,results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27(1):68-73.

    11 Owen CJ,Jennings CE,Imrie H,et al.Mutational analysis of the FOXP3 gene and evidence for genetic heterogeneity in the immunodysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(12):6034-6039.

    12 Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell developmentand the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6(4):331-337.

    13 Asseman C,Mauze S,Leach MW,et al.An essential role for interleukin 10 in the function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation[J].J Exp Med,1999,190(7):995-1004.

    14 Rennick DM,FortMM.Lessons from genetically engineered animal models.Ⅻ.IL-10-deficient(IL-10(-/-)mice and intestinal inflammation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2000,278(6):G829-G833.

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