Faecalibacterium prausnitzii對實驗性結(jié)腸炎大鼠Foxp3+Treg細胞的影響

楊曉彤 張明明 洪 娜 邱新運 于成功*

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科（210008）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種病因不明的炎癥性腸病，目前主要認為該病與免疫、遺傳、環(huán)境和感染等多種因素有關(guān)。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg細胞）是一組能抑制其他免疫細胞活化、增殖的細胞亞群，F(xiàn)oxp3作為X染色體編碼的叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是Treg細胞發(fā)育、分化和功能發(fā)揮必不可少的調(diào)節(jié)因素[1]。益生菌在UC發(fā)病和治療過程中的作用越來越受到重視。Mazmanian等[2]的研究發(fā)現(xiàn)一種腸道共生菌脆弱類桿菌（B.fragilis）對實驗性結(jié)腸炎動物模型有一定的抗炎作用，這種作用是通過細菌產(chǎn)物多糖 A（PSA）來實現(xiàn)的。Faecalibacterium prausnitzii（FP）是存在于正常人腸道內(nèi)的共生菌，與正常人相比，UC患者糞便中FP數(shù)量明顯減少[3]。本實驗通過建立2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的實驗性結(jié)腸炎大鼠模型，并研究FP對TNBS結(jié)腸炎的治療作用，旨在初步探討其治療機制。

材料與方法

一、實驗動物、細菌、主要試劑和儀器

SPF級 Sprague-Dawley（SD）大鼠 60只，體質(zhì)量160～200 g，雌雄各半，由南京大學附屬南京鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供。

FP（ATCC 27766）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）由上海信誼藥廠有限公司饋贈。TNBS購自美國Sigma公司；大鼠白細胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自eBioscience公司；大鼠IL-12 ELISA試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE和固定破膜液購自 eBioscience公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司。流式細胞儀（BD公司）；酶聯(lián)免疫分析儀（2550型）購自日本Bio-Rad公司。

二、方法

1.實驗分組與造模方法：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，稱重編號后隨機分為正常對照組、結(jié)腸炎組、FP組、FP上清液組、培養(yǎng)基組和雙歧桿菌組，每組各10只。后5組大鼠禁食不禁水24 h，制備結(jié)腸炎模型。采用乙醚麻醉后，將直徑約0.2～0.3 cm的橡膠軟管插入大鼠結(jié)腸距肛門8～10 cm處，以TNBS 80 mg/kg+等體積無水乙醇混合液緩慢推入結(jié)腸，將大鼠肛門向上傾斜45°，放置1 min，然后保持平躺狀態(tài)，自然清醒。正常對照組以0.9%NaCl溶液80 mg/kg+等體積無水乙醇混合液灌腸作為對照，其余過程均相同。

2.干預(yù)方法：將生長24 h的細菌培養(yǎng)基混合液離心，菌體以PBS洗滌2次后懸于PBS溶液中，密度調(diào)整至109/ml。上清液凍干成粉狀，以PBS溶解，濃度為原上清液的5倍。造模成功24 h后，正常對照組、結(jié)腸炎組大鼠每日1 mL PBS灌胃，F(xiàn)P組、雙歧桿菌組分別以1 mL FP細菌懸液和長雙歧桿菌懸液灌胃，F(xiàn)P上清液組、培養(yǎng)基組分別以1 mL FP上清液和FP培養(yǎng)基灌胃，連續(xù)7 d。處死大鼠后取距肛門6 cm處結(jié)腸組織行病理切片，并取外周血和脾臟。

3.結(jié)腸炎組織病理學評估：大鼠結(jié)腸組織以4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、透明、浸蠟后進行組織包埋，切片后行HE染色，鏡下觀察。參照Neurath等[4]的研究，行病理學評分：0分為無炎癥；1分為很少量粒細胞浸潤；2分為少量炎性細胞浸潤；3分為大量炎性細胞浸潤，血管增多，結(jié)腸壁增厚；4分為透壁性炎癥，杯狀細胞減少，血管增多和結(jié)腸壁增厚。

4.外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例的檢測：取大鼠腹主動脈血2 mL，以肝素抗凝，按淋巴細胞分離液說明書分離全血淋巴細胞。摘取大鼠脾臟后去外膜，切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨。將全血淋巴細胞和脾臟細胞溶于流式染色緩沖液后，將細胞數(shù)調(diào)至106/管，分別加入 CD4-FITC1.0 μg 和 CD25-APC 0.4 μg 單克隆抗體，4℃避光孵育1 h；清洗離心后，固定/透化工作液4℃避光孵育50 min穿孔；加入Foxp3-PE 1.0 μg，4 ℃避光孵育 1 h，清洗 2 遍后，上流式細胞儀檢測。

5.外周血細胞因子的檢測：大鼠腹主動脈取血2 mL，以肝素抗凝，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-10、IL-12和TGF-β含量。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般情況

正常對照組大鼠因麻醉意外死亡1只；培養(yǎng)基組大鼠因嚴重腸梗阻死亡2只；雙歧桿菌組因麻醉意外死亡1只，嚴重腸梗阻死亡1只，斗毆致外傷死亡1只。

造模后第2 d，結(jié)腸炎組大鼠開始出現(xiàn)腹瀉，為黃色稀便、半稀便甚至血便；大鼠毛色失去光澤，進食和活動明顯減少，體質(zhì)量明顯下降，反應(yīng)遲鈍。給予干預(yù)7 d后，F(xiàn)P組、FP上清液組和雙歧桿菌組大鼠腹瀉好轉(zhuǎn)，大便轉(zhuǎn)為黃色，稍稀或干便，精神逐漸恢復(fù)正常，毛色恢復(fù)光澤，進食和活動逐漸增多。正常對照組和培養(yǎng)基組大鼠無上述各種變化。

二、結(jié)腸大體形態(tài)和組織病理改變

正常對照組和培養(yǎng)基組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，無充血水腫，黏膜下血管正常，腺體排列整齊；結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸黏膜不同程度充血、水腫，有潰瘍形成，以結(jié)腸下段明顯，鏡下可見大量炎性細胞浸潤，黏膜和黏膜下層血管擴張、增多，腺體結(jié)構(gòu)紊亂；FP組、FP上清液組和雙歧桿菌組可見少量炎性細胞浸潤，黏膜稍有充血、水腫，血管增生不明顯，其中FP上清液組療效更為明顯（見圖1）。

與正常對照組相比，結(jié)腸炎組病理學評分顯著升高（P<0.01）。與結(jié)腸炎組相比，F(xiàn)P組、FP上清液組和雙歧桿菌組病理學評分顯著下降（P<0.05），而FP組和FP上清液組與雙歧桿菌相比無明顯差異（見表 1）。

表1 各組大鼠組織病理學評分以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例比較（）

表1 各組大鼠組織病理學評分以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例比較（）

與正常對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與結(jié)腸炎組比較，*P<0.05，**P<0.01；#與培養(yǎng)基組比較，P<0.05

三、外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例

與正常對照組相比，結(jié)腸炎組大鼠外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著降低（P<0.05）；經(jīng)FP和FP上清液治療后，其比例顯著增高（P<0.05），而雙歧桿菌與結(jié)腸炎組相比無明顯差異；FP上清液組外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例明顯高于培養(yǎng)基組（P<0.05）（見表1）。

四、血漿 IL-10、IL-12 和 TGF-β 含量

與正常對照組相比，結(jié)腸炎組大鼠血漿IL-10和TGF-β含量顯著降低（P<0.05），IL-12含量顯著升高（P<0.01），IL-10/IL-12 比值顯著降低（P<0.01）；經(jīng)FP、FP上清液和雙歧桿菌治療后，IL-10含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，IL-12含量明顯下降（P<0.05），IL-10/IL-12 比值顯著升高（P<0.01），TGF-β 含量顯著增高（P<0.05）；FP上清液組 IL-10/IL-12比值和TGF-β含量均顯著高于培養(yǎng)基組（P<0.05）（見表 2）。

討 論

UC是一種病因未明的腸道非特異性炎性疾病，機體對包括腸道微生物在內(nèi)的各種因素產(chǎn)生了異常免疫反應(yīng)。人體消化道寄生著大量細菌，在機體免疫系統(tǒng)正常的情況下，這些細菌與腸道黏膜之間維持免疫平衡和耐受。如某種因素導致腸道菌群失調(diào)，即會打破這種平衡，導致腸道黏膜受損，從而引發(fā)腸道炎癥。腸黏膜上皮細胞和免疫細胞通過Toll樣受體和NOD樣受體特異性識別細菌的分子配體，而這種相互作用能調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)[5]。Kruis等[6]的研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Nissle 1917對UC維持緩解的療效及其安全性與金標準的美沙拉秦相似；另一項隨機雙盲對照試驗[7]顯示，長雙歧桿菌與益生元（Synergy 1）的產(chǎn)物合生元可改善18例急性UC患者的癥狀和炎癥反應(yīng)，說明益生菌在抑制UC炎癥方面起有重要的作用。

腸道黏膜免疫-炎癥反應(yīng)異常在UC發(fā)病中起有重要作用，T細胞是參與這一過程的主要免疫細胞，通過TCR介導識別抗原、活化后，發(fā)揮細胞毒作用或通過分泌細胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。與Th1細胞和Th2細胞不同，Treg細胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，在多種免疫性疾病中起重要作用，雖然其具體的細胞分子通路尚不清楚，但越來越來多的證據(jù)表明Treg細胞能通過多種機制來抑制免疫應(yīng)答。體外實驗證明Treg細胞能抑制其他T細胞的活性，其機制可能是直接通過細胞間的接觸依賴，或通過間接調(diào)節(jié)抗原呈遞細胞的活性[8,9]。目前發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)Treg細胞也能抑制固有免疫反應(yīng)，但能否抑制非T細胞介導的免疫反應(yīng)尚不清楚。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞的特異性標記物，是發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。Brunkow等[10]首先在Scurfy小鼠中證實了Foxp3基因更多表達于CD4+T細胞中；Foxp3是fox蛋白家族成員之一，在CD4+CD25+Treg細胞發(fā)育和功能發(fā)揮中起重要作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3基因突變或敲除的小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量明顯下降，并伴有調(diào)節(jié)功能缺陷，可誘發(fā)嚴重的自身免疫反應(yīng)，因此，F(xiàn)oxp3對機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[12]。

動物實驗[13]證實細胞因子如IL-10和TGF-β在Treg細胞發(fā)揮抑制腸道炎癥的功能中起重要作用。這些分子能對T細胞和其他固有免疫細胞起多種抑制效應(yīng)。IL-10是體內(nèi)重要的抑炎因子，能抑制腫瘤壞死因子（TNF）-α 的分泌，上調(diào) IL-1RA/IL-β 比值，影響干擾素（IFN）-γ的產(chǎn)生。IL-10基因缺失小鼠會發(fā)生以促炎細胞因子分泌紊亂為特征的自發(fā)性腸道炎癥[14]。IL-12是細胞免疫中的重要因子，能通過促進T細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的產(chǎn)生而增加IFN-γ、IL-2、IL-8的生成，從而抑制Th2細胞并促進Th1細胞的作用。IL-10/IL-12比值常用于衡量抑炎效應(yīng)。

本實驗中通過給予結(jié)腸炎模型大鼠FP及其上清液干預(yù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸道炎癥病理改變明顯緩解，糜爛、水腫、炎性細胞浸潤等明顯減輕；同時外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例和血漿TGF-β含量明顯提高，IL-10含量雖無明顯差異，但呈升高趨勢，IL-12含量明顯降低，IL-10/IL-12比值明顯升高。FP及其上清液治療結(jié)腸炎可能的原因為：①FP及其上清液能調(diào)節(jié)免疫功能，通過增加Foxp3的表達，改善腸道免疫狀態(tài)，減輕腸道局部炎癥反應(yīng)，使紊亂的腸道免疫系統(tǒng)恢復(fù)；②FP及其上清液可增加外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，使其對全身免疫系統(tǒng)構(gòu)成良性循環(huán)，有利于整個機體免疫功能的恢復(fù)；③TGF-β含量增加，使原始T細胞更多的向Treg細胞方向轉(zhuǎn)化，從而扭轉(zhuǎn)T細胞亞群的不平衡，而IL-10能通過旁分泌的形式維持Treg細胞Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的表達。

表2 各組大鼠血漿IL-10、IL-12、TGF-β 含量比較（）

表2 各組大鼠血漿IL-10、IL-12、TGF-β 含量比較（）

與正常對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與結(jié)腸炎組比較，*P<0.05，**P<0.01；#與培養(yǎng)基組比較，P<0.05

總之，本實驗通過給予實驗性結(jié)腸炎模型大鼠補充FP及其上清液，發(fā)現(xiàn)其可通過增加Foxp3的表達而提高外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，從而對UC發(fā)揮一定的治療效果，但其更具體的作用組分以及機制尚有待今后研究進一步探討證實。

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