英夫利昔、沙利度胺對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用及其機(jī)制研究*

盛露露 楊曉娣 朱水津 馬天樂(lè) 江石湖

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科（200025）

炎癥性腸?。↖BD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病（CD），歐美國(guó)家比較常見(jiàn)，近年發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。CD是一種慢性非特異性、復(fù)發(fā)與緩解交替的肉芽腫性炎癥，目前病因尚未明確，缺乏根治藥物，需長(zhǎng)期維持用藥，傳統(tǒng)療法存在療效不佳和安全性問(wèn)題。隨著對(duì)IBD發(fā)病機(jī)制的深入研究，其治療已進(jìn)入免疫調(diào)節(jié)分子靶向治療的時(shí)代。生物制劑英夫利昔是針對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的單克隆抗體，臨床效果明顯且見(jiàn)效快，但其具有選擇性，且需序列重復(fù)用藥，價(jià)格昂貴，長(zhǎng)期輸注的安全性亦有待證實(shí)[2,3]。近年研究表明沙利度胺對(duì)TNF-α mRNA具有降解作用，對(duì)IBD的療效基本得到肯定。且相對(duì)英夫利昔，沙利度胺口服方便、價(jià)格低，但應(yīng)注意其可能的毒副作用[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)制備三硝基苯磺酸（TNBS）大鼠結(jié)腸炎模型，并比較英夫利昔、沙利度胺的治療效果，旨在從免疫調(diào)節(jié)、抑制病理性血管生成、抑制凋亡三方面探討兩者治療IBD的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 46 只，體質(zhì)量（200±10） g，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。飼養(yǎng)條件均為SPF級(jí)，晝夜節(jié)律12 h/12 h，無(wú)特殊實(shí)驗(yàn)要求時(shí)正常供應(yīng)飼料和飲水。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2.主要試劑和儀器：50 g/L TNBS溶液（Sigma-Aldrich Co.）；英夫利昔（RemicadeTM，美國(guó) Centocor公司惠贈(zèng)）；沙利度胺（商品名：反應(yīng)停，常州制藥廠有限公司）；TRIZOL抽提試劑（Invitrogen by Life Technologies）；普通PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR 試劑盒（TaKaRa Bio Inc.）；質(zhì)粒抽提試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]；兔抗大鼠 TNF-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、caspase-3 多克隆抗體（Abcam plc.）；GAPDH 多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。實(shí)時(shí)定量PCR儀（Stratagene Mx3000P QPCR System,Agilent Technologies,Inc.）；普通 PCR 儀（GeneAmp,PCR system 9700）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）；紫外分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech,Ultrospec 3000）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.結(jié)腸炎模型的建立和藥物干預(yù)：大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）、結(jié)腸炎組（n=12）、英夫利昔組（n=12）和沙利度胺組（n=12）。造模前大鼠禁食不禁水36 h，經(jīng)乙醚麻醉后，將直徑2 mm的硅膠管從肛門(mén)插入腸道深約8 cm處，注入含TNBS 20 mg的50%（v/v）乙醇溶液約 0.8 mL（TNBS 按照 100 mg/kg給藥加上等體積的無(wú)水乙醇）[5]；正常組給予等量0.9%NaCl溶液灌腸，倒懸位持續(xù)5 min。造模后第1 d，觀察各組大鼠一般情況，將制模成功的大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每天同一時(shí)間段給予藥物干預(yù)，英夫利昔組：英夫利昔（10 mg/mL）腹腔注射 5 mg/kg[6]；沙利度胺組：沙利度胺藥片碾磨成粉狀后溶于橄欖油（50 mg/mL）經(jīng)管喂，200 mg/kg[7]；正常對(duì)照組/結(jié)腸炎組：每組各一半大鼠分別給予等量橄欖油管喂或0.9%NaCl溶液腹腔注射，連續(xù)治療7 d。

2.觀察指標(biāo)：①大鼠的一般情況:每天固定時(shí)間段內(nèi)觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤、活動(dòng)、飲食情況等并記錄體質(zhì)量變化、大便性狀和便血情況，對(duì)后三項(xiàng)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分[8]。②大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分：連續(xù)給藥7 d后，處死各組大鼠，取遠(yuǎn)端結(jié)腸約12 cm，沖洗干凈后行局部結(jié)腸CMDI評(píng)分[9]。 ③組織損傷指數(shù)（TDI）評(píng)分：取部分病變腸段組織立即放于40 g/L多聚甲醛液中固定，石蠟包埋后切片行HE染色和TDI評(píng)分[10]。

3.Real-time PCR檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織TNF-α、VEGF、caspase-3 mRNA表達(dá)：取適量結(jié)腸組織勻漿后，按TRIZOL說(shuō)明書(shū)抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增（PCR特異性引物序列見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳鑒定后割膠回收純化。PMD-18T載體連接PCR純化產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，繼而行細(xì)菌擴(kuò)增和培養(yǎng)。挑選克隆行PCR鑒定，選取條帶與目的條帶相符的細(xì)菌行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genbank相應(yīng)序列匹配一致后，抽提菌液質(zhì)粒，計(jì)算基因濃度。將已知基因濃度的質(zhì)粒逐步10倍稀釋后，行Real-time PCR反應(yīng)。繪制各個(gè)目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各組結(jié)腸樣本cDNA行Real-time PCR反應(yīng)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各標(biāo)本中不同基因的拷貝數(shù)。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) TNF-α、VEGF、caspase-3蛋白表達(dá)：取適量結(jié)腸組織加入1 mL RIPA勻漿，冰浴30 min后12000 r/min 4℃離心30 min。取上清水煮變性后行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，電壓100 V，時(shí)間1 h 30 min，5%脫脂奶粉 37℃封閉 1 h；分別加入兔抗大鼠 TNF-α、VEGF、caspase-3 多克隆抗體（1∶1000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶3000 稀釋），室溫孵育 1 h，ECL顯影；Image-Pro Plus 6.0軟件行灰度掃描分析蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

表1 PCR引物序列

5.TUNEL法檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡：常規(guī)脫蠟水化，20 g/L蛋白酶K 37℃消化30 min，PBS漂洗后浸入封閉液（3%H2O2溶于甲醇），室溫封閉10 min，加 rTdT 酶反應(yīng)液反應(yīng) 60 min，以 1∶100 稀釋的 Streptavidin-HRP 37℃反應(yīng) 30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片鏡檢。細(xì)胞呈棕褐色顆粒者，并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，判斷為凋亡細(xì)胞。

6.免疫組化法檢測(cè) TNF-α、VEGF、caspase-3 表達(dá)：常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；正常山羊血清室溫封閉 20 min；滴加兔抗大鼠 TNF-α（1∶2000）、VEGF（1∶200）、caspase-3（1∶100）一抗，4 ℃過(guò)夜；加入山羊抗兔二抗室溫靜置或37℃ 1 h；DAB顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸炎模型

1.一般情況：造模后24 h，正常對(duì)照組大鼠一般情況基本正常，體質(zhì)量基本無(wú)變化。其余三組大鼠均出現(xiàn)稀便、血便或隱血試驗(yàn)陽(yáng)性，毛發(fā)豎起，精神不佳，飲食、活動(dòng)減少，體質(zhì)量下降。結(jié)腸炎組造模后第2～4 d平均DAI評(píng)分達(dá)到高峰，在造模后7 d內(nèi)無(wú)明顯下降趨勢(shì)；而英夫利昔組、沙利度胺組給藥后第2 d開(kāi)始部分大鼠一般情況稍有改善，稀便、便血減少，活動(dòng)、飲食增加，同時(shí)體質(zhì)量開(kāi)始緩慢升高。結(jié)腸炎組平均DAI評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01），英夫利昔組、沙利度胺組明顯低于結(jié)腸炎組（P<0.01），英夫利昔組平均DAI評(píng)分明顯低于沙利度胺組（P<0.01）（見(jiàn)表 2）。

2.大體形態(tài)學(xué)改變：正常對(duì)照組大鼠腸壁薄而光滑，周圍結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)黏連。結(jié)腸炎組大鼠病變部位腸黏膜充血水腫，嚴(yán)重節(jié)段性糜爛、潰瘍、壞死，腸壁與周圍組織黏連，腸腔狹窄，部分大鼠結(jié)腸近端呈巨結(jié)腸樣改變，腸壁僵硬易斷；英夫利昔組、沙利度胺組僅表現(xiàn)為局部黏膜充血水腫，糜爛潰瘍基本愈合，腸壁增厚或瘢痕形成，黏連無(wú)或減輕，少部分存在輕度糜爛和淺潰瘍。結(jié)腸炎組CMDI評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），英夫利昔組、沙利度胺組明顯低于結(jié)腸炎組（P<0.05），英夫利昔組與沙利度胺組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)表2）。

3.組織病理學(xué)改變：正常對(duì)照組結(jié)腸上皮完整，細(xì)胞形態(tài)正常，固有層腺體排列規(guī)則，各層結(jié)構(gòu)清晰；結(jié)腸炎組黏膜上皮壞死脫落，潰瘍糜爛形成，全層透壁性炎癥，大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)血管增生和肉芽組織，全層結(jié)構(gòu)消失；英夫利昔組、沙利度胺組潰瘍基本愈合，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腸壁結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（見(jiàn)圖1）。結(jié)腸炎組平均TDI評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），英夫利昔組、沙利度胺組明顯低于結(jié)腸炎組（P<0.05），兩治療組無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)表 2）。

表2 各組大鼠平均 DAI、CMDI、TDI評(píng)分比較（）

表2 各組大鼠平均 DAI、CMDI、TDI評(píng)分比較（）

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與結(jié)腸炎組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；#與沙利度胺組比較，P<0.01

二、Real-time PCR結(jié)果

結(jié)腸炎組結(jié)腸組織 TNF-α、VEGF、caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），英夫利昔組、沙利度胺組明顯低于結(jié)腸炎組（P<0.05），而兩治療組間均無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TNF-α、VEGF、caspase-3 mRNA表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TNF-α、VEGF、caspase-3 mRNA表達(dá)比較（）

*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#與結(jié)腸炎組比較，P<0.05

三、蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸炎組結(jié)腸組織TNF-α、VEGF、caspase-3 蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05），英夫利昔組、沙利度胺組蛋白表達(dá)較結(jié)腸炎組均明顯下降（P<0.05），兩治療組間TNF-α蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而英夫利昔組VEGF、caspase-3蛋白表達(dá)均明顯低于沙利度胺組（P<0.05）（見(jiàn)圖2）。

四、結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡

正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸上皮僅少量凋亡細(xì)胞，結(jié)腸炎組凋亡現(xiàn)象普遍，英夫利昔組、沙利度胺組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡明顯改善（見(jiàn)圖 3）。

五、免疫組化

TNF-α在正常對(duì)照組大鼠腸組織中基本無(wú)表達(dá)，結(jié)腸炎組腸上皮細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)明顯棕色強(qiáng)表達(dá)，而英夫利昔組、沙利度胺組TNF-α表達(dá)明顯減弱，呈散在表達(dá)；VEGF在正常對(duì)照組表達(dá)較弱，結(jié)腸炎組腸上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間質(zhì)炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中均可見(jiàn)VEGF強(qiáng)表達(dá)，英夫利昔組、沙利度胺組表達(dá)均明顯減弱；正常對(duì)照組caspase-3表達(dá)較弱，結(jié)腸炎組表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，主要位于腸上皮細(xì)胞質(zhì)和部分胞核，英夫利昔組、沙利度胺組表達(dá)明顯減弱（見(jiàn)圖4）。

討 論

目前IBD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，建立適當(dāng)?shù)哪c道炎癥動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制和藥物療效具有積極意義。在多種構(gòu)建腸道炎癥動(dòng)物模型的方法中，TNBS/乙醇法目前的應(yīng)用最為廣泛，該方法誘發(fā)的體內(nèi)免疫反應(yīng)以Th1型反應(yīng)為主，類似于人類CD。本實(shí)驗(yàn)采用TNBS/乙醇混合液灌腸制備大鼠結(jié)腸炎模型，結(jié)腸炎組大鼠平均DAI、CMDI、TDI評(píng)分與正常對(duì)照組相比均顯著升高，提示造模成功。

腸道黏膜免疫異常在IBD的發(fā)病中處于中心地位，反復(fù)抗原刺激使腸黏膜免疫細(xì)胞聚積、激活，并刺激黏膜固有層細(xì)胞因子激活和分泌增加，如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-12、TNF-α、干擾素（IFN）-γ 等，促進(jìn)Th1型炎癥的發(fā)生。TNF-α作為一種促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在CD免疫反應(yīng)和病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究表明活動(dòng)性IBD患者血液、腸上皮組織以及糞便中TNF-α水平均明顯升高[11]。

IBD患者腸黏膜組織反復(fù)形成潰瘍和上皮再生，血管生成是IBD中的必然過(guò)程。正常情況下，促血管形成因子與抑制因子處于平衡狀態(tài)，一旦打破會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管過(guò)度生成或抑制。促血管形成因子-抑制因子的平衡狀態(tài)、微環(huán)境以及IBD患者異常表達(dá)的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)生理性血管生成向病理性血管生成的演變，且這種病理性血管生成可能對(duì)IBD慢性炎癥的發(fā)生和維持起一定作用。近年有學(xué)者提出病理性血管生成可作為IBD的發(fā)病因素之一[12,13]。另一方面，炎癥和免疫反應(yīng)對(duì)病理性血管生成亦起調(diào)節(jié)作用。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在IL-10基因敲除和DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性和急性腸道炎癥模型中，僅在活動(dòng)性炎癥浸潤(rùn)的區(qū)域可見(jiàn)明顯血管生成。VEGF是最直接的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素，與受體結(jié)合后發(fā)揮一系列促進(jìn)血管生成的生物學(xué)功能。研究[15]表明血清VEGF水平與IBD的疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，VEGF是監(jiān)測(cè)血管生成的重要指標(biāo)之一。

目前，越來(lái)越多的研究證實(shí)IBD炎癥腸黏膜組織內(nèi)存在細(xì)胞凋亡紊亂。腸上皮細(xì)胞是腸黏膜屏障的重要機(jī)械屏障，完整的腸上皮細(xì)胞不僅能阻止細(xì)菌和毒素等大分子滲透至腸黏膜固有層，還能激活固有層免疫細(xì)胞以維護(hù)腸黏膜屏障功能的穩(wěn)定，避免黏膜異常免疫反應(yīng)的發(fā)生[16]。研究表明IBD存在大量結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致上皮損傷，破壞腸黏膜屏障，這也是造成IBD腸道炎癥發(fā)生和持續(xù)的重要原因[17]。caspase是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，caspase-3在凋亡的執(zhí)行階段對(duì)全部或部分關(guān)鍵性蛋白進(jìn)行酶切，從而引起凋亡的激活或滅活，活化的caspase-3可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記。

慢性復(fù)發(fā)頑固性IBD患者的治療仍是臨床面臨的挑戰(zhàn)，高達(dá)1/3的IBD患者對(duì)傳統(tǒng)治療無(wú)效或耐受。對(duì)于這部分患者，英夫利昔單抗的療效較好。英夫利昔是針對(duì)TNF-α的人鼠嵌合性單克隆抗體，與TNF-α結(jié)合后可激活補(bǔ)體和抗體介導(dǎo)的活動(dòng)性CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)。目前英夫利昔已用于對(duì)常規(guī)保守治療無(wú)效以及活動(dòng)性瘺管形成的中重度CD患者。雖然生物治療的療效肯定，但部分患者的身體狀況以及經(jīng)濟(jì)情況限制了其使用，且隨著抗抗體產(chǎn)生而降低療效，生物制劑長(zhǎng)期使用的安全性問(wèn)題（如感染、惡性腫瘤等）亦存在諸多爭(zhēng)議[18]。沙利度胺具有抑制TNF-α的作用，近年發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成等活性。1997年Wettstein等[19]首先采用沙利度胺治療1例對(duì)皮質(zhì)類固醇治療無(wú)效的CD患者，取得良好效果。動(dòng)物模型研究[20]發(fā)現(xiàn)沙利度胺通過(guò)下調(diào)促炎因子基因的表達(dá)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞-粒細(xì)胞的相互作用，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的CD樣結(jié)腸炎起治療作用；Bariol等[21]發(fā)現(xiàn)沙利度胺對(duì)IBD患者癥狀的短期療效較好；羅政仁等[22]的隨機(jī)對(duì)照研究認(rèn)為沙利度胺對(duì)輕中度CD患者有效，且其療效優(yōu)于傳統(tǒng)藥物柳氮磺吡啶。由此可見(jiàn)，沙利度胺可望成為治療IBD的一種新型藥物。但沙利度胺治療CD的作用機(jī)制較復(fù)雜，尚未有統(tǒng)一的定論。有學(xué)者[23]指出對(duì)英夫利昔治療有反應(yīng)的患者，沙利度胺可作為其維持緩解的橋接治療。

本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)腸炎組 DAI、CMDI、TDI評(píng)分明顯升高，TNF-α、VEGF、caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)亦顯著升高，腸上皮細(xì)胞凋亡顯著增加；英夫利昔組、沙利度胺組上述各項(xiàng)指標(biāo)均較結(jié)腸炎組明顯改善，且英夫利昔組VEGF蛋白表達(dá)明顯低于沙利度胺組，提示兩種治療藥物對(duì)IBD炎癥的療效較好；能有效抑制IBD病理性血管生成，且英夫利昔抑制血管生成的作用略優(yōu)于沙利度胺；兩種藥物能有效抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸黏膜上皮屏障。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明英夫利昔、沙利度胺均能通過(guò)抑制TNF-α、VEGF、caspase-3表達(dá)， 對(duì) IBD 的免疫失衡、病理性血管生成以及腸上皮細(xì)胞凋亡起調(diào)節(jié)作用。對(duì)于傳統(tǒng)治療無(wú)效且無(wú)法使用英夫利昔的IBD患者，沙利度胺可能是治療的一種新選擇；對(duì)于英夫利昔治療有反應(yīng)者，其維持緩解治療可以沙利度胺替代，能明顯降低費(fèi)用。但仍需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)注意沙利度胺可能的毒副作用。

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