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    甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白對人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的影響*

    2012-10-22 07:48:42楊玉嘉
    天津藥學(xué) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:蘇丹紅脂滴成脂

    楊玉嘉,張 凱,白 雪,王 毅

    (天津市天津醫(yī)院,天津 300211)

    PTHrP最初是從引起高鈣血癥的惡性腫瘤組織中分離出來,其與甲狀旁腺激素在編碼基因、分子結(jié)構(gòu)和受體功能上有許多相同或相似之處[1]。但PTHrP促進(jìn)骨合成代謝的分子機(jī)制尚未十分清楚,還須作進(jìn)一步研究。本實驗分析了PTHrP(1-86)作用于人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)后其脂肪特異性基因脂蛋白脂肪酶(LPL)的表達(dá),以進(jìn)一步闡述其對基質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 骨髓來源 5份骨髓標(biāo)本均來源于本院創(chuàng)傷性股骨頭置換手術(shù)患者,其中男3例,女2例,年齡37~45歲,已確診供者無骨代謝疾病,無急、慢性感染且均經(jīng)本人同意。

    1.1.2 主要試劑和儀器 PTHrP(PeproTech公司,美國),DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco BRL公司),淋巴細(xì)胞分離液、胰島素、地塞米松、β-甘油磷酸鈉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司),MTT(Sigma公司),α萘酚磷酸鹽(Koch-Light Laboratories Ltd),1%蘇丹紅染色液(蘇丹紅IV 1 g溶入體積分?jǐn)?shù)為0.7乙醇溶液中過濾備用),逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒(TaKaRa,寶生物工程有限公司),酶聯(lián)免疫測定儀(MRXⅡ,美國Dynex),定量PCR儀(ABI 7300,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1 hMSCs的分離培養(yǎng)及分組 分別無菌抽取各患者骨髓5~10 ml,采用淋巴細(xì)胞分離液分離法,取單個核細(xì)胞層,DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次,沉淀物用含10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液混懸,移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)hBMSCs生長融合達(dá)80%左右,用0.25%胰酶消化傳代細(xì)胞,取第3代細(xì)胞用于實驗。將每個樣本的實驗細(xì)胞分為三組:對照組,采用10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng);成脂誘導(dǎo)組,采用成脂誘導(dǎo)液(含1×10-8mol/L地塞米松、10mg/L胰島素的10%FBS-DMEM/F12[2])培養(yǎng);成脂 +PTHrP 組,采用成脂誘導(dǎo)液 +40 nMPTHrP培養(yǎng)。每48 h換液1次。

    1.2.2 對細(xì)胞生長增殖的影響 分別取各組的第3代細(xì)胞按5×104/ml濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每48 h換液1次,采用MTT法分別檢測各組第2、4、6、8 d時的細(xì)胞增殖情況。

    1.2.3 成脂蘇丹紅 IV染色 第3代細(xì)胞按1×105/ml濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上,每48 h換液1次,于第10、14、21日時分別對各組進(jìn)行蘇丹紅IV染色。

    1.2.4 對 LPL表達(dá)的影響 第3代細(xì)胞按1×105/ml濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上,每48 h換液1 次,分別于第3、5、10、21 日時以 TRIZOL 試劑提取細(xì)胞總RNA并測定濃度,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR Green PCR試劑盒于熒光定量檢測儀進(jìn)行相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增:95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 31 s,共40個循環(huán)。用每個樣本的Ct值采用2-ΔΔt方法計算mRNA的相對表達(dá)量。各基因的引物序列見表1。

    表1 基因引物序列

    1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以±s表示,計量資料多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 實驗各組細(xì)胞增殖水平的比較 成脂誘導(dǎo)組、成脂+PTHrP組細(xì)胞增殖均顯著高于對照組(P<0.01);成脂誘導(dǎo)組比成脂+PTHrP組,前期無顯著性差異,從第4日起前組顯著高于后組(P<0.05),見表2。

    2.2 實驗各組成脂蘇丹紅IV染色 第7日時成脂誘導(dǎo)組的蘇丹紅IV染色開始出現(xiàn)少量細(xì)小紅色脂滴,14日時細(xì)小脂滴逐漸增多,第21日時則胞漿內(nèi)可見大量呈顆粒狀的紅色脂滴;成脂+PTHrP組14日時才出現(xiàn)脂滴,但脂滴數(shù)量明顯低于同期成脂誘導(dǎo)組;而對照組各染色點(diǎn)均未出現(xiàn)紅色脂滴,見圖1。

    2.3 實驗各組成脂LPL mRNA的表達(dá)水平 LPL mRNA表達(dá)水平各實驗組比較,成脂誘導(dǎo)組和成脂+PTHrP組均顯著高于對照組(P<0.05),成脂+PTHrP組顯著低于成脂誘導(dǎo)組,(P<0.05),見表3。

    表2 實驗各組細(xì)胞增殖水平(±s,n=5)

    表2 實驗各組細(xì)胞增殖水平(±s,n=5)

    與對照組比較,*P<0.01;與成脂誘導(dǎo)組比較,△P <0.05,△△P <0.01

    組別 第2日 第4日 第6日 第8日對照組 0.284 ±0.011 0.355 ±0.020 0.393 ±0.022 0.504 ±0.052成脂誘導(dǎo)組 0.395 ±0.021* 0.497 ±0.012* 0.616 ±0.035* 0.753 ±0.031*成脂 +PTHrP 組 0.373±0.016* 0.431 ±0.022*△ 0.527±0.023*△ 0.635±0.023*△△

    圖1 hMSCs成脂誘導(dǎo)實驗各組蘇丹紅IV染色

    表3 實驗各組成脂LPL m RNA的表達(dá)水平(x±s,n=3)

    3 討論

    人類PTHrP基因組DNA定位于第12號染色體基因短臂[3],主要包括9個外顯子和3個啟動子。PTHrP基因的前mRNA通過選擇性剪接,產(chǎn)生三種原始翻譯產(chǎn)物PTHrP(1-139)、PTHrP(1-141)和 PTHrP(1-173),然后通過轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽修飾等多種水平的基因調(diào)控,形成具有不同的N末端、中間區(qū)域和C末端的成熟肽以及這些形式的結(jié)合物。只有成熟肽及其結(jié)合物才具有其獨(dú)特的生物學(xué)功能。PTHrP(1-34)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)是這個肽家族的主要分泌形式。近年來一些研究表明,PTHrP在胎兒和成人骨中也具有很強(qiáng)的協(xié)同骨形成的作用[4,5]。與PTH不同的是,PTHrP只是純粹的合成代謝劑,只選擇性地刺激骨形成。因此PTHrP在治療骨質(zhì)疏松中具有廣泛的應(yīng)用前景,對其研究也日趨增多,但在骨合成代謝中的分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚[6,7]。

    本實驗分析比較了PTHrP(1-86)片段在hMSCs脂肪分化過程中的影響。有研究證實,MSCs在體外可通過不同的誘導(dǎo)劑分別向成骨和成脂方向分化[8]。本研究中,分別采用不同的誘導(dǎo)液培養(yǎng)hMSCs。表2結(jié)果顯示,成脂誘導(dǎo)組和成脂+PTHrP組的細(xì)胞增殖均顯著高于對照組,成脂+PTHrP組第2日時無顯著性增殖,從第4日起增殖顯著低于成脂誘導(dǎo)組。說明PTHrP(1-86)在后期有抑制成脂化細(xì)胞的增殖作用。圖1和表3結(jié)果顯示,成脂+PTHrP組出現(xiàn)脂滴陽性細(xì)胞的時間最晚,脂滴量相對于成脂誘導(dǎo)組較少;脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因LPLmRNA的表達(dá)水平也顯著低于成脂誘導(dǎo)組,由此可見PTHrP(1-86)在MSCs的成脂肪分化的過程中起到了抑制作用。有研究證明,MSCs具有內(nèi)在的成骨和成脂肪分化潛能,兩者之間的分化相互關(guān)聯(lián)[9]。通過本實驗分析,PTHrP可能是通過抑制MSCs的成脂肪分化,而刺激骨形成,為其治療骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

    1 郭剛,劉新宇,梁東春,等.重組人甲狀旁腺素相關(guān)蛋白PTHrP1-86對骨質(zhì)疏松大鼠治療作用的實驗研究.中國骨質(zhì)疏松雜志,2008,14(1):13

    2 黃定強(qiáng),楊大鑒,黎萬榮,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系.中國臨床康復(fù),2006,10(1):31

    3 李瑛.甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的新認(rèn)識.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué),2003,12(4):362

    4 Miao D,Li J,Xue Y,etal.Parathyroid hormone-related peptide is required for increased trabecular bone volume in parathyroid hormone-null mice.Endocrinology,2004,145(8):3554

    5 Miao D,He B,Jiang Y,et al.Osteoblast-derived PTHrP is a potent endogenous bone anabolic agent that modifies the therapeutic efficacy of administered PTH 1 -34.JClin Invest,2005,115(9):2402

    6 Antonio Casado - Díaz,Raquel Santiago - Mora,JoseéManuel Quesada.The N- and C-terminal domains of parathyroid hormone-related protein affect differently the osteogenic and adipogenic potential of human mesenchymal stem cells.Experimental and Molecular Medicine,2010,42(2):87

    7 徐進(jìn),榮海欽.甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白促進(jìn)骨形成.國外醫(yī)學(xué)·骨科學(xué)分冊,2005,26(4):242

    8 岑洪,林茂芳,黃河,等.雌激素受體α和β在間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨、成脂肪分化中的表達(dá)變化.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005,22(6):883

    9 黃定強(qiáng),楊大鑒,黎萬榮,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系.中國臨床康復(fù),2006,10(1):31

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