復(fù)方益母片微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

天津市南開醫(yī)院（300100）馬順英

復(fù)方益母片是由益母草、雞血藤、當(dāng)歸等4味中藥組成的中藥制劑，具有補(bǔ)血，活血的功效。根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定，藥品在進(jìn)行微生物限度檢查前必須對(duì)其檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)該供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后再進(jìn)行檢查，才能真實(shí)反映該藥品受污染的程度[1]。結(jié)果證實(shí)復(fù)方益母片的細(xì)菌，霉菌，酵母菌和控制菌檢查均采用常規(guī)法進(jìn)行。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LIBRORAEG120電子天平（日本島津）；YJA電動(dòng)勻漿儀（臺(tái)州市椒江五星機(jī)械儀器有限公司）；MJX-1501培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

1.2試藥與培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)120206），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)110211），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)110410），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)120111），pH7.0 的無菌氫氧化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)1102222），改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)080408），均為中國藥品生物制品檢定所提供；復(fù)方益母片（批號(hào)20120706）。

1.3菌種 大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃～35℃，培養(yǎng)18～24小時(shí)；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)18小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)約為50～100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7天后，加入4mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用管口帶有薄的無菌棉花吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)約為50～100cfu的孢子懸液。

2.2供試液的制備 取本品10g，加pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，用勻漿儀，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3方法驗(yàn)證

2.3.1細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證

2.3.1.1細(xì)菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證

2.3.1.1.1試驗(yàn)組 ①常規(guī)法：取2.2項(xiàng)下制備的供試液1mL和1mL試驗(yàn)菌（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取均值。

2.3.1.1.2菌液組 取1mL試驗(yàn)菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)（分別為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）。

2.3.1.1.3供試品 對(duì)照組按試驗(yàn)組的方法，不加菌懸液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品菌數(shù)（本底菌）。

2.3.1.1.4稀釋劑 對(duì)照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個(gè)平皿中，培養(yǎng)基注皿，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.1.2霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證

2.3.1.2.1試驗(yàn)組 ①常規(guī)法：取2.2項(xiàng)下制備的供試液1mL和1mL試驗(yàn)菌（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。在23℃～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取均值。

2.3.1.2.2菌液組 取1mL試驗(yàn)菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)（分別為白色念珠菌和黑曲霉菌）。

2.3.1.2.3供試品 對(duì)照組按試驗(yàn)組的方法，不加菌懸液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品菌數(shù)（本底菌）。

2.3.1.2.4稀釋劑 對(duì)照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個(gè)平皿中，培養(yǎng)基注皿，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

附表1 常規(guī)法測定各試驗(yàn)菌株的回收率（%）

附表2 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

試驗(yàn)組菌回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)－供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/試驗(yàn)組菌落數(shù)×100%；稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)/試驗(yàn)組菌落數(shù)×100%。

《中國藥典》規(guī)定對(duì)各試驗(yàn)菌株的回收率均不得低于70%，用常規(guī)法測定該品種對(duì)5個(gè)試驗(yàn)菌株的回收率，以確定其抑菌程度。結(jié)果見附表1。

由附表1可知本品對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均無抑菌作用。

2.3.2控制菌檢查法的驗(yàn)證 結(jié)果見附表2。

2.3.2.1大腸埃希菌檢查法的驗(yàn)證

2.3.2.1.1試驗(yàn)組 取10mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液和1mL大腸埃希菌（約50～100cfu）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.3.2.1.2陰性菌對(duì)照組 取10mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液和1 mL金黃色葡萄球菌（約50～100cfu）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.3.2.1.3陽性對(duì)照組 取1mL 大腸埃希菌（約50～100mL）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

取試驗(yàn)組、陰性菌對(duì)照組和陽性對(duì)照組上述培養(yǎng)物各0.2mL，分別接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，試驗(yàn)組管MUG陽性，靛基質(zhì)陽性；陰性菌對(duì)照組MUG陰性，靛基質(zhì)陰性；陽性對(duì)照組管MUG陽性，靛基質(zhì)陽性。

2.3.2.1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽性對(duì)照組檢出大腸埃希菌；陰性菌對(duì)照組未檢出大腸埃希菌；試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌。驗(yàn)證結(jié)果符合要求。

2.3.2.2大腸菌群檢查法的驗(yàn)證

2.3.2.2.1試驗(yàn)組 取1mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液和1mL大腸埃希菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.3.2.2.2陰性菌對(duì)照組 取1mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液和1mL金黃色葡萄球菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.3.2.2.3陽性對(duì)照菌 取1mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液和1mL大腸埃希菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。

試驗(yàn)組管和陽性對(duì)照組管均有菌生長且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性菌對(duì)照組無菌生長且不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組檢出大腸菌群；陰性菌未檢出大腸菌群；陽性對(duì)照組檢出大腸菌群。結(jié)果符合要求。

2.3.2.3供試品控制菌檢查 取10mL 2.2項(xiàng)下制備的供試液置100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查，結(jié)果樣品每1g中未檢出大腸埃希菌。

2.3.2.4本品為口服給藥制劑，致病菌應(yīng)作大腸埃希菌，其陰性對(duì)照采用金黃色葡萄球菌。

由附表2得出結(jié)論：試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌。

2.4結(jié)果 復(fù)方益母片微生物限度檢查方法試驗(yàn)結(jié)果為細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用平皿法；控制菌采用常規(guī)法。

3 討論

中藥制劑的微生物限度檢查通常是按常規(guī)的藥品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的。由于中成藥是含有多種成分的復(fù)方制劑，其中任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)以5種陽性對(duì)照菌的回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了復(fù)方益母片的微生物限度檢查方法。

該方法可用于復(fù)方益母片微生物的質(zhì)量控制。