在A549細(xì)胞中靶向p66Shc shRNA的沉默效應(yīng)

陳 娜 ，王曉洋 ，杜 瑋 ，孫亞楠 ，李西川 ，馬振毅 ，劉 喆 ，3

（天津醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)重點實驗室；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3.免疫學(xué)教研室，天津300070）

在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)3種Shc基因：ShcA、ShcB、ShcC[1]。ShcA蛋白家族共有3個成員，分別是p46Shc，p52Shc，p66Shc[2]，他們都有一個 SH2 結(jié)構(gòu)域，一個中心脯氨酸豐富區(qū)（CH1）和一個磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PTB），但p66Shc還含有一個獨特的N-端結(jié)構(gòu)域(CH2)，位于該結(jié)構(gòu)域的第36位絲氨酸是p66Shc活化的關(guān)鍵調(diào)控位點[3]，p66Shc正是通過此位點發(fā)揮抑制胰島素樣生長因子-I的功能[4]。越來越多的實驗證實p66Shc與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，p66Shc很可能是評價前列腺癌和冠狀動脈疾病預(yù)后好壞的有價值的生物標(biāo)志物之一[5-6]，但詳細(xì)的作用機制仍需深入研究。如果在表達p66Shc的癌細(xì)胞中運用RNA干擾技術(shù)把p66Shc的表達水平下調(diào)，細(xì)胞會出現(xiàn)什么樣的生物學(xué)變化，此為進一步研究p66Shc蛋白的生物學(xué)功能進而深入探討腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移機制提供了又一研究工具。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo），蛋白質(zhì)電泳儀器（Bio-Rad），倒置熒光顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器廠），低溫高速離心機（Eppendorf），酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、Phoenix-293細(xì)胞來自本實驗室，培養(yǎng)條件：細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度下用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。質(zhì)粒pSuper.retro.puro（pSRP）和慢病毒包裝系統(tǒng)來自本實驗室，限制性內(nèi)切酶來自NEB，E.coli DH5α和質(zhì)粒提取試劑盒購于原平皓試劑有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購于Hyclone，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物購自Invitrogen,Cell proliferation ELISA BrdU購自Roche，抗beta-actin和p66Shc抗體分別BD Biosciences Millipore抗鼠二抗購自Jackson Lab，底物Chemiluminescent HRPsubstrate購自Millipore。

1.2 pSRP-ip66Shc質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定 根據(jù)哺乳動物真核細(xì)胞shRNA的Tuschl AA-19nt的設(shè)計原則，從p66Shc基因的mRNA序列中篩選1條shRNA靶序列，并合成相應(yīng)的正義和反義DNA模板。利用Ambion shRNA在線軟件設(shè)計了針對p66Shc的shRNA：5′-GATCCCCCGGAATGAGTCTCTGTCATCGTTCAAGAGACGATGACAGAGACTCATTCCGTTTTTA-3′,3′-GGGGCCTTACTCAGAGACAGTAGCAGTTCTCTGCTACTGTCTCTGAGTAAGGCAAAAATTCGA-5′，用熒光素酶基因的shRNA-iluc作對照。將引物10000×g離心10min，加入水稀釋到3mg/mL，然后在25μL體系（TEpH8.0buffer）中，加入各1.5μL的引物，95℃3min，37℃退火1 h，最終至室溫。連接反應(yīng)：用Bgl II和Hin d III酶切pSRP載體，割膠回收后的pSRP載體片段2μL，退火的DNA片段6μL，加入1μL 10×連接Buffer和 1μLT4 DNA Ligase，連接2 h，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化子pSRP-ip66Shc。質(zhì)粒的鑒定：用Eco RI和Xho I酶切鑒定。

1.3 277-ip66Shc質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定 用Eco RI酶切質(zhì)粒pSRP-ip66Shc，再用T4 DNA polymerase補平缺口，純化后用Xho I酶切DNA片段，回收該DNA片段。用Eco RV和Xho I酶切277載體，割膠回收后備用。連接反應(yīng)：回收的277載體片段2μL，DNA片段6μL，加入1μL 10×連接Buffer和1μL T4DNA Ligase，連接過夜。之后轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化子277-ip66Shc。質(zhì)粒的鑒定：用Bam HI和Xho I酶切鑒定。

1.5 A549細(xì)胞的感染 感染當(dāng)天，A549細(xì)胞密度為60%~70%，棄去細(xì)胞液，加入含有polybrene(6 μg/mL)的病毒，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，48 h以后更換為正常培養(yǎng)基。如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，馬上換為正常培養(yǎng)基；感染3 d后首先觀察GFP的表達情況，收集總蛋白進入后續(xù)Western Blot實驗。

1.6 半定量RT-PCR檢測p66ShcmRNA水平 總RNA抽取根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行，均為RNase-free操作。在轉(zhuǎn)染后的35mm細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1mL的Trizol，室溫放置5min，加入200μL氯仿，用力震蕩1min，室溫放置5min；4℃，12 000×g，20min離心；從每管中吸取上清至另一1.5mLEppendorf管，加入1/2體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20℃沉淀20min；4℃，13 000×g離心20min后，去上清；加入1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；4℃，13 000×g離心5min，棄上清；加入50μLRNase-free水，至完全溶解。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。p66Shc引物F：CAGCCATGCCAGACTCAGGC，R：CACACACCAGACTGATGGCCT。GAPDH 引物 F：GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA，R：GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT，檢測p66Shc-shRNA在mRNA水平上的變化。

1.7 Western blot檢測p66Shc蛋白的表達水平 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量的預(yù)冷Laemmli sample buffer（62.5mmol/LTris-HCl,pH 6.8,25%glycerol，2%SDS，5%β-mercaptoethanoland 0.01%BromophenolBlue）；冰上裂解細(xì)胞10min，用預(yù)冷的刮刀將細(xì)胞刮下；超聲破碎細(xì)胞（200W共4次，每次3 s，間隔 3 s）；4℃，12 000×g，離心 5min；100℃加熱變性10min；SDS-PAGE:根據(jù)目的蛋白大小，采用Bio-Rad電泳裝置將總蛋白進行SDS-PAGE分離；電轉(zhuǎn)移：在4℃，200mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移80min，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；封閉：用TBST(TBS+0.1%Tween-20)含5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗孵育：用含有5%牛奶的TBST分別稀釋內(nèi)參β-Actin一抗（1∶5 000）和 p66Shc一抗（1∶2 000），室溫下與封閉好的NC膜孵育2 h或4℃過夜；洗膜：TBST洗膜3次，每次5min；二抗孵育：用含有5%牛奶的TBST稀釋與一抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗（1∶2 000），于室溫下孵育 1 h；洗膜：TBST 洗膜3次，每次10min；顯色反應(yīng)：用Chemiluminescent HRPsubstrate作用在膜上3min，于暗房中曝光于X線底片上。

1.8 BrdU標(biāo)記細(xì)胞增殖 以每孔1×103細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)1 d，加入BrdU（終濃度為10μmol/L），37℃，孵育 4 h；棄培養(yǎng)液，加入Fix Denat 200μL，室溫?fù)u床孵育30min；棄上清，加入抗BrdU抗體（工作濃度1∶100），室溫?fù)u床孵育1.5 h；棄上清，PBS洗滌3次；加底物反應(yīng)5 min，再加入1mol/L H2SO4每孔25μL終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀檢測在波長為450nm、690nm（參考波長）的吸光度，重復(fù)10個孔。

2 結(jié)果

2.1 pSRP-ip66Shc和277-ip66Shc質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定 將合成的shRNA引物退火后與Bgl II和Hin dⅢ酶切回收后的pSRP載體連接后做轉(zhuǎn)化；用Eco RI和Xho I酶切質(zhì)粒pSRP-ip66Shc，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，得到320bp的條帶，空載體得到250bp的條帶（圖1）。用Eco RI酶切質(zhì)粒pSRP-ip66Shc，再用T4 DNA polymerase補平，純化后用Xho I酶切DNA片段，得到320bp條帶，然后回收該320bp的條帶。用Eco RV和Xho I酶切277載體，割膠回收后備用。連接277載體與回收的DNA片段，得到的質(zhì)粒再用Bam HI和Xho I酶切，得到1條850bp的條帶，空載體得到1條530bp的條帶（圖2）。

圖1 pSRP-ip66Shc質(zhì)粒的酶切鑒定Fig 1 Restriction enzym edigestion of pSRP-ip66Shc plasm id

圖2 277-ip66Shc質(zhì)粒的酶切鑒定Fig 2 Restriction enzym edigestion of 277-ip66Shc plasm id

2.2 p66Shc的沉默效應(yīng)

2.2.1 半定量RT-PCR檢測p66Shc的mRNA水平的變化 將轉(zhuǎn)染過病毒的對照組和shRNA病毒的細(xì)胞提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，然后用p66Shc的引物和GAPDH引物做半定量PCR，實驗組的p66Shc的mRNA表達量比對照組明顯降低，而GAPDH表達沒有變化。多次重復(fù)實驗中，p66Shc-shRNA慢病毒對目標(biāo)基因p66Shc在mRNA水平有明顯下調(diào)作用（圖3）。

圖3 半定量RT-PCR檢測p66Shc的mRNA水平Fig 3 Sem i-q RT-PCR detection of p66Shc mRNA level

2.2.2 Westernblot檢測p66Shc蛋白表達變化 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞的p66Shc的表達發(fā)現(xiàn)，加shRNA病毒的細(xì)胞比對照細(xì)胞表達p66Shc蛋白明顯減少，幾乎就沒有再表達p66Shc（圖4）。

圖4 Western blot檢測p66Shc蛋白表達Fig 4 W estern blot detection of p66Shc protein level

2.3 下調(diào)p66Shc之后影響細(xì)胞增殖 根據(jù)吸光值（450 nm吸光值減690 nm吸光值）分析細(xì)胞增殖結(jié)果。發(fā)現(xiàn)對A549細(xì)胞下調(diào)p66Shc之后細(xì)胞增殖明顯減少（圖5）。轉(zhuǎn)染277-ip66Shc的實驗組細(xì)胞增殖情況與轉(zhuǎn)染277-iluc對照組細(xì)胞相比，t=18.7，P<0.001。

圖5 BrdU實驗檢測細(xì)胞增殖Fig 5 BrdU detection of cellproliferation

3 討論

由于信號銜接蛋白ShcA對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起重要的調(diào)控作用，近年來引起了廣泛的關(guān)注。在小鼠中將p66Shc基因敲除可使小鼠減少糖尿病誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而抑制糖尿病腎病的發(fā)生[7]，提示p66Shc是一個氧化還原狀態(tài)的決定因子：在基因敲除p66Shc的小鼠中，巨噬細(xì)胞中的氧化物是減少的[8]。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)p66Shc分布在粘著斑中，一旦細(xì)胞失去貼附的胞外基質(zhì)，通過激活RhoA來介導(dǎo)失巢凋亡（一種特異的細(xì)胞脫離生長基質(zhì)后而啟動的細(xì)胞凋亡）[9]。失巢凋亡對機體的正常發(fā)育至關(guān)重要，它可以確保脫離生長基質(zhì)的細(xì)胞死亡,而耐受失巢凋亡的則是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)之一[10]。p66Shc可以通過降低Ras的活性來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]。本研究通過構(gòu)建針對p66Shc靶向的shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖、mRNA水平以及蛋白表達水平等幾個方面進行干擾前后的檢測對比，證實p66ShcRNA干擾后導(dǎo)致p66Shc的mRNA表達下調(diào)，同時抑制了p66Shc蛋白表達，進而減少了細(xì)胞的增殖，這說明細(xì)胞的增殖與細(xì)胞中p66Shc蛋白表達及其mRNA水平密切相關(guān)，同時也說明p66Shc參與的細(xì)胞信號傳遞途徑對腫瘤細(xì)胞的增殖起到重要的作用。本研究對進一步研究p66Shc功能及其信號傳遞途徑提供了有效的基因沉默研究工具，相關(guān)研究工作正在進行中。

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