飛秒激光操控細(xì)胞的研究

冉玲苓，石宏新，尹志剛

（1．黑龍江大學(xué) 電子工程學(xué)院，哈爾濱 150080；2．黑龍江科技學(xué)院 理學(xué)院，哈爾濱 150027）

0 引 言

光鑷是一種以激光的力學(xué)效應(yīng)為基礎(chǔ)的物理工具，是強(qiáng)會聚光場與微粒相互作用時(shí)形成的光學(xué)勢阱。貝爾實(shí)驗(yàn)室的A．Ashkin在這一領(lǐng)域做出了開創(chuàng)性的工作。1970年，A．Ashkin首次在實(shí)驗(yàn)室中觀察到激光的輻射力，成功地完成了激光懸浮微粒的實(shí)驗(yàn)［1］，他提出了利用光壓操縱微粒的思想，并建立了一套利用光壓來操縱微粒的工具［2－3］。

光鑷技術(shù)出現(xiàn)之后，A．Ashkin和J．Dziedzic分別對病毒和細(xì)菌進(jìn)行了捕獲和操控的實(shí)驗(yàn)［4－5］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明適當(dāng)?shù)募す夤β蕦ι锝M織不會造成明顯的損傷。隨后，研究者們陸續(xù)利用光鑷技術(shù)開展了細(xì)胞融合、硅球排列、細(xì)胞分離、測定馬達(dá)蛋白作用力及運(yùn)動步幅、克服分子馬達(dá)引起的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)動力等多方面的工作［6］。這充分表明光鑷技術(shù)是一項(xiàng)極具活力的新興技術(shù)，它的出現(xiàn)為生命科學(xué)等多方面的發(fā)展提供了新的研究手段。

天津大學(xué)首先提出了飛秒激光光鑷的概念，他們提出飛秒激光光鑷與連續(xù)光光鑷不同的是在飛秒光鑷中作用在粒子上的光學(xué)梯度力是脈沖式［7］；王清月領(lǐng)導(dǎo)的課題組以高重復(fù)率飛秒激光為光源對血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、聚苯乙烯微球、病毒等均實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定捕獲，并比較了飛秒激光與連續(xù)激光的捕獲能力。他們對單細(xì)胞的操作和光動力學(xué)對癌細(xì)胞的診斷和治療方面進(jìn)行了研究，提出了光動力治療法［8］；圣德安魯斯大學(xué)的研究小組采用單光束梯度力光阱對1．28μm的硅球進(jìn)行了研究［9］；M．Gu等人利用飛秒激光單光束梯度力光阱，測量了黃綠熒光10μm微球的雙光子激發(fā)效應(yīng)與形貌的依賴關(guān)系［10］；韓國延世大學(xué)的研究小組分別使用飛秒激光光阱和連續(xù)激光單光束梯度力光阱對生物細(xì)胞進(jìn)行了捕獲和操縱，他們把隨著粒子的減小捕獲效率的差異不斷增大這一現(xiàn)象歸因于飛秒激光自聚焦效應(yīng)［11－12］。

自A．Ashkin等人發(fā)明光鑷后，光鑷由于其非接觸、無損傷操縱微納米尺度粒子的特性而被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理、材料等學(xué)科領(lǐng)域，被認(rèn)為是最理想的單分子、單細(xì)胞、微粒等微納器件的操控工具。飛秒激光是一種發(fā)展迅速的超短脈沖激光，相對于納秒或皮秒激光脈沖，飛秒激光脈沖具有極短的脈沖寬度和極高的峰值功率，因此飛秒激光作為光鑷的光源與生物組織相互作用時(shí)幾乎不傷及周圍區(qū)域，因而具有極高的空間分辨率。目前作者利用飛秒激光顯微操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對人體血紅細(xì)胞、酵母細(xì)胞的穩(wěn)定捕獲。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 實(shí)驗(yàn)裝置

飛秒激光光鑷系統(tǒng)主要由飛秒激光光源、功率調(diào)節(jié)器、光束耦合器、顯微鏡主體、載物臺與CCD圖像顯示系統(tǒng)幾部分組成，基本的光路見圖1。

圖1 飛秒光鑷系統(tǒng)的基本光路圖Fig．1 Basic beam path of femtosecond optical tweezers system

本文采用Ti：sapphire激光器作為飛秒激光光鑷系統(tǒng)的光源，泵浦光中心波長為532nm，激光器輸出的飛秒脈沖序列的中心波長為800nm，脈沖寬度為120fs，重復(fù)頻率為76MHz。將光束嚴(yán)格調(diào)整引入顯微鏡后，經(jīng)鏡物聚焦后形成光學(xué)勢阱。借助于顯微鏡配備的照明系統(tǒng)，可以對飛秒激光光鑷的捕獲過程進(jìn)行實(shí)時(shí)地觀察。高倍率大數(shù)值孔徑的物鏡可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)梯度光場，并且具有較高的放大倍率，便于清楚地觀察光鑷對物體的操縱過程。但大數(shù)值孔徑同時(shí)也意味著工作距離短，尤其在筆者的實(shí)驗(yàn)中采用的是正置式顯微鏡，由于受此限制，待捕獲樣品必須置于特制的培養(yǎng)皿中，其厚度不得大于顯微鏡物鏡的工作距離。本文通過衰減片可以對激光強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。飛秒激光脈沖通過顯微鏡的物鏡聚焦到樣品之前經(jīng)過耦合光路使光與顯微鏡內(nèi)置光路同軸并齊焦。顯微鏡的載物臺放置在由3個(gè)線性激勵(lì)源控制的XYZ三維移動平臺上。激勵(lì)源由計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制，同時(shí)通過CCD圖像顯示系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控操作過程，并進(jìn)行圖像的采集。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

開啟照明燈，打開CCD攝像記錄程序，調(diào)整照明光源的亮度，使CCD圖像亮度適中，視場清晰。選用100×數(shù)值孔徑為0．9的物鏡聚焦激光束捕獲酵母細(xì)胞，配合粗調(diào)和精調(diào)手輪緩慢調(diào)焦，在顯示器視頻窗口觀察，使樣品池中的樣品圖像清晰。調(diào)節(jié)樣品臺手柄控制樣品臺的移動，選擇要捕獲操作的區(qū)域。將光阱位置靠近待捕獲的酵母細(xì)胞。

圖2為橫向捕獲一個(gè)酵母細(xì)胞的記錄過程。實(shí)線圓圈指示的是被捕獲的酵母細(xì)胞，虛線圓圈指示為參考細(xì)胞。圖2中箭頭方向指示三維移動平臺的移動方向，筆者觀察到背景中的酵母細(xì)胞跟隨平臺移動，而被捕獲的酵母細(xì)胞被光阱束縛而不動，即實(shí)現(xiàn)了飛秒光鑷操控酵母細(xì)胞水平平移。同樣筆者也進(jìn)行了飛秒光鑷操控酵母細(xì)胞豎直方向的平移運(yùn)動以及斜線方向的運(yùn)動。在圖3中給出了豎直平移操控的記錄圖像。在捕獲圖像中可以看到，被捕獲的酵母細(xì)胞的圖像逐漸變虛，說明酵母細(xì)胞已離開成像的物平面，此時(shí)需要縱向調(diào)整焦距才可以重新看清樣品。這是由于當(dāng)激光功率過大時(shí)，產(chǎn)生的散射力推動樣品向前運(yùn)動而離開物平面。這也說明此數(shù)值孔徑物鏡聚焦激光束會聚角小，光強(qiáng)梯度小以至捕獲的穩(wěn)定性較差。

在飛秒光鑷操控酵母細(xì)胞運(yùn)動的過程中發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞相對背景移動的路徑上如果遇到其它的酵母細(xì)胞有時(shí)會同時(shí)捕獲多個(gè)酵母細(xì)胞，并同時(shí)隨光阱移動；有時(shí)則會出現(xiàn)失去對原本捕獲的酵母細(xì)胞而捕獲移動路徑上遇到的新的酵母細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)軸向可以捕獲多個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象是由于軸向會聚度不夠高所致，其光阱在軸向上尺寸大于徑向，垂直方向上可以容納多個(gè)細(xì)胞。而對于交換捕獲細(xì)胞的現(xiàn)象筆者分析是因?yàn)樵谝苿舆^程中，移動路徑上遇到的酵母細(xì)胞所處的軸向深度比原始被捕獲的細(xì)胞對于光阱來說位置更佳，所以占據(jù)了被捕獲的位置。

血紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀 （碟狀），直徑約為7 μm，未經(jīng)激光照射時(shí)，細(xì)胞自由懸浮于濃度為0．9%的生理鹽水中，并作隨機(jī)的布朗運(yùn)動。操控記錄見圖4，圖中用黑色圓圈指示待捕獲細(xì)胞，箭頭方向指示平臺的移動方向。

飛秒激光光阱位置固定不變，通過計(jì)算機(jī)控制平臺的移動，將待捕獲細(xì)胞移向光阱位置，當(dāng)細(xì)胞接近激光光斑約數(shù)μm時(shí)，細(xì)胞就快速的被吸引至光斑中心。受激光照射后細(xì)胞在光學(xué)力的作用下發(fā)生空間翻轉(zhuǎn)，其碟面垂直于載物臺，觀察到被捕獲的細(xì)胞變?yōu)殚L條啞鈴形，見圖4。繼續(xù)以一定速度移動載物臺，其它自由細(xì)胞隨之移動，而被捕獲的細(xì)胞在光學(xué)勢阱的作用下靜止不動，充分證明了血紅細(xì)胞已經(jīng)被飛秒激光脈沖穩(wěn)定捕獲。若停止飛秒激光的照射，被捕獲細(xì)胞則快速恢復(fù)到初始的自由運(yùn)動狀態(tài)。

圖4 飛秒激光對血紅細(xì)胞的捕獲過程Fig．4 Progress of femtosecond laser control the red blood cells

2 光鑷捕獲酵母細(xì)胞的能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚的展現(xiàn)了飛秒光鑷捕獲酵母細(xì)胞的全過程。這里本文討論飛秒光鑷的捕獲能力，一般通過比較Q值來衡量光鑷的捕獲能力，同時(shí)筆者也可以對其捕獲對象所受的光阱力進(jìn)行測量，以酵母細(xì)胞為捕獲對象來進(jìn)行光阱力的測量和Q值的計(jì)算。

2．1 酵母細(xì)胞所受光阱力的測量

在相對靜止的液體環(huán)境中，用光來捕獲一個(gè)酵母細(xì)胞，通過手動或計(jì)算機(jī)控制樣品臺，令被捕獲細(xì)胞相對周圍環(huán)境在平面上產(chǎn)生定向運(yùn)動。光鑷的一個(gè)較重要的功能就是微小力的測量。知道光阱力與位移的關(guān)系就可以測定外力的大小。因?yàn)楣廒逯械牧Ｗ悠x光阱中心時(shí)，粒子將受到一個(gè)指向光阱中心的光阱力，起到回復(fù)力的作用。當(dāng)光阱中心的微粒受到其它外力時(shí)，微粒將偏離光阱中心，發(fā)生位移到一個(gè)新的位置，在新的位置處粒子受到的光阱力與外力平衡。光鑷系統(tǒng)的阱力標(biāo)定通?？梢圆捎昧黧w力學(xué)法、熱運(yùn)動分析法、功率譜法和外加周期驅(qū)動力法。在筆者的工作中使用最常用的實(shí)驗(yàn)方法流體力學(xué)法來測量飛秒光鑷捕獲酵母細(xì)胞的光阱力。流體力學(xué)的方法是以一定流速的穩(wěn)恒流體中，粒子受到的流體對它的黏滯力為標(biāo)準(zhǔn)力，可以由流體力學(xué)中的Stokes公式給出：

其中η為黏滯系數(shù)；r為被捕獲細(xì)胞的半徑；ˉv為流體相對微粒的速度。

根據(jù)此公式可以算出光鑷的光阱力，細(xì)胞在光阱中受到的力與細(xì)胞偏離光阱中心的距離有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中，光鑷系統(tǒng)中的光路調(diào)整后，液體相對微粒的運(yùn)動是平臺帶動的。當(dāng)微粒進(jìn)入光阱后，開始手動令平臺以較小的速度運(yùn)動，若細(xì)胞仍在光鑷的控制中即處于被捕獲的狀態(tài)，則可以通過計(jì)算機(jī)控制逐步加大平臺的移動速度，這樣不停地調(diào)整平臺移動速度，直到平臺的速度達(dá)到某種臨界值，被捕獲的細(xì)胞不再受光阱束縛，能夠從光阱中逃逸出去，此時(shí)的平臺移動速度即為細(xì)胞的逃逸速度。將這個(gè)速度值代入Stokes公式，即可求出光阱力的大小。

由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的局限，只能測得細(xì)胞逃逸時(shí)的平均速度?？紤]到平臺啟動時(shí)對細(xì)胞的加速影響較大，因此通過直接設(shè)定平臺移動速度來測量逃逸速度的誤差將比較大，所以采取手動的方法來測量逃逸速度。手動測量逃逸速度的方法使用CCD攝像機(jī)來跟蹤采集一系列捕獲過程，對采集到的影像文件進(jìn)行分割處理，截取出細(xì)胞逃逸前后兩幀連續(xù)的圖像，測出逃逸前后細(xì)胞的位移再除以兩幀圖像的時(shí)間間隔，可以計(jì)算出逃逸速度。在具體的實(shí)驗(yàn)過程中，分別選用了不同的激光入射功率：30、40、50、60、80mW。為了盡量減小實(shí)驗(yàn)以及處理數(shù)據(jù)時(shí)帶來的誤差，分別對多組位置進(jìn)行重復(fù)測量。表1中給出功率為30mW時(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 酵母細(xì)胞0．04s時(shí)間內(nèi)位移變化Table 1 Displacement of yeast cells in 0．04s

用統(tǒng)計(jì)方法求出速度平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

速度為：

這里測量的隨機(jī)誤差較大，是實(shí)驗(yàn)誤差的主要來源。在光阱力的測量中，最大速度應(yīng)該是逃逸速度，即細(xì)胞掙脫光阱力的束縛一剎那的速度，這個(gè)速度為瞬時(shí)速度，在實(shí)驗(yàn)中是手動移動細(xì)胞，不可避免會出現(xiàn)非勻速的情況。使用CCD拍攝的影像記錄通過軟件進(jìn)行截圖后通過計(jì)算處理得到，其處理過程中多處步驟會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)，因此計(jì)算結(jié)果只是一個(gè)粗略的近似值。

2．2 飛秒激光光鑷捕獲酵母細(xì)胞的Q值

Q值一般可由下式表示［9］：

其中η為流體的黏滯系數(shù)；d為樣品微粒的直徑；k為深度影響因子［13］，在本實(shí)驗(yàn)中，樣品位于溶液的中部，k取值1；c為光速；v為逃逸速度；n為樣品周圍液體的折射率；p為照射到樣品上激光的平均功率。

由式 （2）可見，在實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，光鑷的捕獲能力取決于逃逸速度與平均功率的比值。在光阱力的研究中筆者已經(jīng)測得不同飛秒激光平均功率下被捕獲細(xì)胞的逃逸速度。這里給出實(shí)驗(yàn)獲得的v～p關(guān)系見圖5。由圖5可見，隨著入射激光功率的增加，細(xì)胞的逃逸速度隨之不斷增加。入射激光功率增大，激光作用于細(xì)胞的梯度力也隨之增大，能夠束縛細(xì)胞使之運(yùn)動的速度也增大。但逃逸速度并不隨入射激光功率的增大而線性增大，且斜率是逐漸減小的。根據(jù)式 （2）中各個(gè)量之間的關(guān)系可以得出Q值隨著入射激光功率的增加將越來越小。由表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算出了飛秒光鑷的Q值，平均值為0．007。

圖5 逃逸速度和照射到酵母細(xì)胞上激光平均功率的關(guān)系圖Fig．5 Escape speed versus the average power on the yeast cells

3 結(jié) 論

本文介紹了自行搭建的飛秒光鑷系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)及各組成部件的功能。利用該系統(tǒng)分別對人體血紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞進(jìn)行了捕獲和操縱的實(shí)驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了對比和定性分析。通過流體力學(xué)方法對酵母細(xì)胞所受到的光阱力進(jìn)行了定量的測量并給出計(jì)算結(jié)果，所得到的光阱力大小在皮牛頓量級。

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