厄貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀影響冠心病大鼠心肌及主動脈干s分泌型磷脂酶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

郭麗蓉 孫常青

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部科，福建廈門 361003

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）又稱缺血性心臟病，是因冠狀動脈供血不足，心肌急劇的、暫時的缺血與缺氧所引起的綜合征，常引發(fā)心絞痛、心肌梗死以致心力衰竭等的臨床病癥，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。冠心病的病理、生理過程，包括動脈粥樣硬化、斑塊破裂及局部血栓形成、冠狀動脈痙攣等。分泌型磷脂酶A2（typeⅡsecretory phospholipase A2，sPLA2）屬于鈣依賴的磷脂酶家族，有研究提示，sPLA2影響了動脈粥樣硬化過程，并在粥樣斑塊中有高度表達(dá)[1]。sPLA2-Ⅴ是sPLA2異構(gòu)體之一，其在動脈粥樣硬化形成中的作用鮮有報道，本研究通過觀察厄貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)影響冠心病大鼠模型心肌及主動脈干sPLA2-Ⅴ的表達(dá)，以分析其在冠心病發(fā)病過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物及主要試劑

厄貝沙坦（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：J20030113）；瑞舒伐他?。ò⑺估抵扑幱邢薰?，批準(zhǔn)文號：H20060406）；垂體后葉素注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；膽固醇（天津市博迪化工有限公司生產(chǎn)）；膽酸鈉（鄭州程達(dá)化工產(chǎn)品有限公司）；丙硫氧嘧啶（德國赫爾布蘭德大藥廠）；sPLA2-Ⅴ抗血清、sPLA2-Ⅴ單克隆抗體及檢測試劑盒（Boehringer Mannheim公司）；DAB（武漢子心生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組 50只Wistar大鼠自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)于18～22℃的清潔級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、厄貝沙坦組、瑞舒伐他汀組及厄貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀組（簡稱聯(lián)合用藥組），每組各10只。

1.3.2 動物造模 正常組以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠每日以高脂飼料喂養(yǎng)（含2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、87.3%基礎(chǔ)飼料，于末次灌胃前72 h開始，每次灌胃30 min后，腹腔注射垂體后葉素30 U/kg，隔日1次，連續(xù)注射3次，建立冠心病心肌缺血模型[2-3]。正常組予以等容量的生理鹽水注射。

1.3.3 給藥方法 大鼠造模成功后，各組大鼠以相應(yīng)的藥物給藥，厄貝沙坦組大鼠以厄貝沙坦 50 mg/（kg·d）灌胃；瑞舒伐他汀組大鼠以瑞舒伐他汀10 mg/（kg·d）灌胃；聯(lián)合用藥組予厄貝沙坦 50 mg/（kg·d）+瑞舒伐他汀 10 mg/（kg·d）灌胃；正常組和模型組予以每日2 mL生理鹽水灌胃，均持續(xù)12周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 采集標(biāo)本 給藥12周后，各組大鼠禁食12 h，麻醉后迅速開胸剖取心臟和主動脈，于心尖部取適量的左心室心肌組織，將心肌組織和主動脈用預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸濕后，放入4%多聚甲醛液中固定。

1.4.2 免疫組化檢測sPLA2-Ⅴ的表達(dá) 取上述心肌組織和主動脈標(biāo)本，立即送冰凍切片，厚度10 μm，分別加入1∶100的sPLA2-Ⅴ抗血清及8.8 mg/L的sPLA2-Ⅴ單抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗DAB顯色。sPLA2-Ⅴ陽性細(xì)胞呈棕紫藍(lán)色，位于細(xì)胞漿內(nèi)，高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，每個視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個，按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[4]，①按照陽性細(xì)胞比例評分，1 分：＜10%，2 分：10%～50%，3分：＞50%；②按染色強(qiáng)弱評分，0分：陰性；1分：淡黃色染色；2分：中度黃色染色；3分：棕黃色染色?？偡?陽性細(xì)胞得分×染色強(qiáng)弱得分，總分＜3分為陰性，總分≥3分為陽性。以PBS代替一抗作為空白對照，采用試劑公司提供的陽性組織切片作陽性對照，正常心肌組織和主動脈標(biāo)本作為陰性對照。

1.4.3 Western blot檢測sPLA2-Ⅴ表達(dá)水平 取上述心肌組織和主動脈標(biāo)本，加入1 mL組織裂解液，于冰浴中勻漿20次，隨后轉(zhuǎn)入EP管中，4℃離心1 h，取上清，以微量Lowrry法測定sPLA2-Ⅴ蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達(dá)比較

見表1。

表1 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達(dá)比較（n=10）

2.2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達(dá)水平比較

見表2。

表2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達(dá)水平比較（±s，U/mL，n=10）

表2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達(dá)水平比較（±s，U/mL，n=10）

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，※P ＜ 0.01；與模型組比較，△P ＜ 0.05，▲P＜0.01；與厄貝沙坦組及瑞舒伐他汀組比較，●P＜0.05

組別 sPLA2-Ⅴ表達(dá)水平心肌組織 主動脈正常組模型組厄貝沙坦組瑞舒伐他汀組聯(lián)合用藥組1.51±1.23 6.43±1.55※4.25±0.87★△4.67±0.59★△2.04±1.11▲●2.06±1.17 7.81±1.96※4.13±1.02★△4.75±1.27★△2.88±1.64▲●

3 討論

SPLA2主要由血管壁平滑肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，在正常的動脈中，sPLA2主要分布于中膜的平滑肌細(xì)胞。在動脈粥樣硬化斑塊中，sPLA2主要與膠原纖維一起位于巨噬細(xì)胞集聚區(qū)、粥樣硬化的脂質(zhì)核心區(qū)以及病變血管內(nèi)膜的細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)。sPLA2-Ⅴ是近幾年發(fā)現(xiàn)的新的sPLA2的分型，其主要分布在人和鼠類的心臟及來源于巨噬細(xì)胞中。國外研究中發(fā)現(xiàn)sPLA2-Ⅴ可在動脈粥樣斑塊中檢測出來。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）是一類抗高血壓和抗充血性心力衰竭藥，能擴(kuò)張冠狀動脈，減輕心臟前后負(fù)荷，降低心肌耗氧，對抗心臟RAS的縮血管和水鈉潴留作用，中斷心力衰竭時的心臟惡性循環(huán)[4]。厄貝沙坦是ACEI類藥物，研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦可降低sPLA2的表達(dá)及相應(yīng)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用[5]。由此推測厄貝沙坦也可能抑制sPLA2-Ⅴ的表達(dá)起到抗動脈硬化的作用。另外，有學(xué)者指出，在冠心病心絞痛擴(kuò)張冠狀血管治療的同時，調(diào)解血脂，對改善血液流變性至關(guān)重要[6]。阿托伐他汀對sPLA2Ⅱα在動脈粥樣硬化大鼠表達(dá)的影響也有報道。但是有關(guān)于sPLA2-Ⅴ與瑞舒伐他汀藥物相關(guān)性的研究尚未報道。

本課題以厄貝沙坦、瑞舒伐他汀、厄貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)冠心病大鼠模型后，免疫組化結(jié)果顯示，正常大鼠心肌及主動脈組織中sPLA2-Ⅴ呈陰性表達(dá)，而冠心病模型大鼠sPLA2-Ⅴ均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而經(jīng)過厄貝沙坦、瑞舒伐他汀干預(yù)后，sPLA2-Ⅴ表達(dá)減弱，但聯(lián)合用藥組表達(dá)最弱，接近正常組，說明厄貝沙坦及瑞舒伐他汀均可以抑制sPLA2-Ⅴ表達(dá)，但以聯(lián)合用藥效果最顯著。另外，Western blot蛋白定量結(jié)果也顯示，sPLA2-Ⅴ在模型組中高表達(dá)，顯著高于其余各組，但經(jīng)過藥物干預(yù)后，厄貝沙坦、瑞舒伐他汀及聯(lián)合用藥組sPLA2-Ⅴ表達(dá)水平顯著下降，以聯(lián)合用藥組下降最顯著，說明厄貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀用藥下調(diào)sPLA2-Ⅴ表達(dá)效果顯著優(yōu)于單一用藥。

綜上所述，貝沙坦聯(lián)合瑞舒伐他汀可能通過抑制心肌及主動脈干sPLA2-Ⅴ的表達(dá)起到抗動脈粥樣硬化治療冠心病作用，可作為心血管疾病高危人群的一級預(yù)防用藥。

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