采用不同載體的玻璃化冷凍對(duì)人卵巢組織凍存效果的比較研究

黃麗麗 王文軍 李瑞岐 歐陽(yáng)能勇 楊冬梓

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣東廣州 510120

卵巢組織冷凍可以為卵巢早衰或癌癥需要放化療的患者提供恢復(fù)生育能力及內(nèi)分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷凍是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的冷凍方法，該技術(shù)將冷凍對(duì)象直接投入液氮中快速降溫，避免冰晶形成，可以繞開(kāi)組織內(nèi)不同細(xì)胞成分對(duì)慢速冷凍參數(shù)要求不同的技術(shù)障礙，從而提高冷凍保存效果。玻璃化冷凍的降溫速度直接決定冷凍保護(hù)劑能否形成玻璃態(tài)，而使用的載體是影響降溫速度的最重要因素。雖然目前應(yīng)用玻璃化方法凍存人卵巢組織已有陸續(xù)報(bào)道，其中采用的載體包括冷凍管[2]、開(kāi)放式麥管[3]、最小微滴法[4]以及不銹鋼網(wǎng)篩[5]等，然而究竟何種載體更適合人卵巢組織玻璃化冷凍，需進(jìn)一步研究。固相表面玻璃化技術(shù)（solid-surface vitrification，SSV）是近年新出現(xiàn)的一種簡(jiǎn)便有效的玻璃化方法，筆者前期曾成功將其用于玻璃化冷凍人卵巢組織片，并取得了與慢速程序化冷凍相當(dāng)?shù)男Ч鸞6]。本研究的目的是比較固相表面玻璃化冷凍和其他載體相比，對(duì)人卵巢組織玻璃化冷凍的效果。

1 材料與方法

1.1 人卵巢組織標(biāo)本的收集與預(yù)處理

卵巢標(biāo)本取自2011年11月～2012年6月就診于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科、需經(jīng)腹或行腹腔鏡手術(shù)的16例患者，年齡 21～40 歲，平均（32.7±5.9）歲；有規(guī)律的月經(jīng)史，無(wú)內(nèi)分泌紊亂，無(wú)放化療史，半年內(nèi)無(wú)激素服用史，且卵巢囊腫直徑＜7 cm。其中，良性卵巢囊腫8例，子宮肌瘤5例，宮頸癌3例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究得到了中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

新鮮卵巢組織浸泡于含10%人血白蛋白+青鏈雙抗的L-15培養(yǎng)液（Gibco公司）中，于體式顯微鏡下去除多余髓質(zhì)后，切成約5 mm×1 mm×1 mm大小的皮質(zhì)小條，隨機(jī)分配到不同的實(shí)驗(yàn)組：新鮮組（F組）、冷凍管玻璃化組（TV組）、最小微滴玻璃化組（MDS組）、不銹鋼網(wǎng)篩玻璃化組（SLV組）和固相表面玻璃化組（SSV組）。新鮮組直接以4%多聚甲醛液固定。

1.2 玻璃化冷凍和復(fù)蘇過(guò)程

采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）的L-15溶液為玻璃化冷凍液。將卵巢組織依次浸泡于4℃25%、50%、75%和100%濃度的玻璃化冷凍液中逐步導(dǎo)入冷凍保護(hù)劑后，采用不同載體行玻璃化冷凍：①TV組將卵巢置于含有1 mL 4℃100%玻璃化冷凍液的無(wú)菌冷凍管中投入液氮；②MDS組用無(wú)菌的巴氏管將卵巢組織直接滴入液氮中；③SLV組將卵巢組織置不銹鋼網(wǎng)篩上投入液氮中；④SSV組將卵巢組織置于已在液氮中預(yù)冷的鋁箔上投入液氮中，在液氮面之下將卵巢組織收集入冷凍管中液氮保存。

復(fù)蘇時(shí)將冷凍管從液氮中取出，靜置10 s，除TV組將冷凍管置于37℃水浴中2～3 min取出卵巢組織外，MDS組、SLV組和SSV組打開(kāi)冷凍管取出卵巢組織，將其依次轉(zhuǎn)移到0.5、0.25和0.125 mol/L蔗糖溶液中，洗滌后于37℃培養(yǎng)箱中靜置備用。

1.3 人卵巢皮質(zhì)片的體外培養(yǎng)

卵巢組織體外培養(yǎng)體系參考文獻(xiàn)[7]。將復(fù)蘇的卵巢組織置于嵌入式培養(yǎng)皿Millicell-ORG（Millipore公司）上培養(yǎng)。培養(yǎng)液成分：α-MEM液，2.5%人白蛋白，1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉ITS（含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉），500 mIU/mL重組人促卵泡生成素（rhFSH）以及青鏈雙抗。培養(yǎng)10 d，每2天更換新鮮培養(yǎng)液，吸出的培養(yǎng)液用于激素測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后所有的卵巢組織用于組織學(xué)檢測(cè)。

1.4 組織學(xué)分析

卵巢組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，行HE染色，每10個(gè)切片在光鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)一次。原始卵泡和初級(jí)卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記，盲法計(jì)數(shù)每個(gè)標(biāo)本中形態(tài)正常的原始卵泡和初級(jí)卵泡。參照Gougeon標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行卵泡分級(jí)和卵泡形態(tài)評(píng)價(jià)。

1.5 雌孕激素的測(cè)定

將更換的培養(yǎng)液收集于無(wú)菌EP管中，置于-20℃冰箱保存，培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)一采用美國(guó)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)ACS：180SE測(cè)定雌孕激素水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組織學(xué)結(jié)果，對(duì)培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮的測(cè)定采用GLM中重復(fù)測(cè)量的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢皮質(zhì)組織學(xué)分析結(jié)果

冷凍前后的組織切片在光鏡下均可見(jiàn)到形態(tài)正常和閉鎖的卵泡（圖1）。凍融后各組卵巢組織中卵泡形態(tài)正常率低于F組（P＜0.05）。其中，SSV組原始和初級(jí)卵泡正常形態(tài)率最高（P＜0.05），其次為MDS組和SLV組，后兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TV組卵泡正常形態(tài)率最低（P＜0.05）（表1）。

圖1 凍融前后卵巢組織中不同級(jí)別的卵泡HE染色（×400）

表1 新鮮組和四組凍融后卵巢組織中原始和初級(jí)卵泡的平均正常形態(tài)率（±s，%）

表1 新鮮組和四組凍融后卵巢組織中原始和初級(jí)卵泡的平均正常形態(tài)率（±s，%）

注：F組為新鮮組；TV組為冷凍管組；MDS組為最小微滴組；SLV組為不銹鋼網(wǎng)篩組；SSV組為固相表面玻璃化組；與F組比較，*P＜0.05；與TV組比較，#P＜0.05；與 SSV組比較，▲P＜0.05

組別 原始卵泡 初級(jí)卵泡F組TV組MDS組SLV組SSV組90.27±6.02 64.57±11.84*78.36±7.62*#▲77.21±6.51*#▲84.70±5.03*83.56±7.99 59.95±15.27*72.34±9.72*#▲71.60±9.53*#▲79.75±6.54*

2.2 卵巢組織的體外培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)體外10 d培養(yǎng)后，各組卵巢皮質(zhì)的邊緣變圓滑。光鏡下各組卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)后均可見(jiàn)到存活卵泡，見(jiàn)圖2。如圖2所示，與新鮮未培養(yǎng)卵巢組織相比，培養(yǎng)后的各組卵巢組織中原始卵泡所占的比例均下降（P＜0.05），生長(zhǎng)卵泡（包括初級(jí)和次級(jí)卵泡）比例均上升（P＜0.05）。新鮮未培養(yǎng)組原始卵泡和生長(zhǎng)卵泡的比例分別為85.96%和14.04%；TV組培養(yǎng)后為60.66%和33.34%；MDS組培養(yǎng)后為 56.24%和43.76%；SLV組培養(yǎng)后分別為54.79%和45.21%；SSV組培養(yǎng)后為46.0%和54.0%。SSV組凍融組織體外培養(yǎng)后初級(jí)卵泡比例明顯高于其他冷凍組（P＜0.05），同時(shí)原始卵泡所占比例明顯低于其他冷凍組（P＜0.05）。TV組培養(yǎng)后兩類(lèi)卵泡比例與其他各組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），培養(yǎng)后MDS組和SLV組的兩級(jí)卵泡所占比例組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 新鮮組和培養(yǎng)后各玻璃化組卵巢組織中原始卵泡和初級(jí)卵泡所占比例

2.3 培養(yǎng)液中激素的測(cè)定結(jié)果

體外培養(yǎng)的10 d中，與新鮮培養(yǎng)液相比，復(fù)蘇后卵巢組織培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮的平均水平隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高（圖3A、3B）。SSV組雌二醇和孕酮平均濃度明顯高于其他組（P＜0.05）。TV組的兩種激素水平均顯著低于其他各組（P＜0.05）。MDS組與SLV組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各玻璃化組卵巢組織體外培養(yǎng)液中雌二醇（A）和孕酮（B）的濃度

3 討論

玻璃化冷凍過(guò)程需要一個(gè)特殊的載體承載冷凍保護(hù)液和組織細(xì)胞，對(duì)于卵巢組織而言，載體需要一定的容積同時(shí)要盡量減少所需冷凍液的體積以提高降溫速度。此外，當(dāng)組織被浸入液氮中時(shí)，沸騰的氮?dú)獍诮M織周?chē)?，由于其低?dǎo)熱性形成有效的絕熱區(qū)從而減緩了降溫速度[9]。由此可見(jiàn)，載體的選擇要考慮上述多種影響因素。目前已有多種載體被實(shí)驗(yàn)性地應(yīng)用于玻璃化冷凍過(guò)程，如冷凍管（cryovial）、開(kāi)放式拉長(zhǎng)麥管[10]、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩等。

冷凍管被應(yīng)用于卵巢組織的程序化冷凍，但因管壁較厚和所需較多冷凍液，導(dǎo)致降溫速度慢，不能滿(mǎn)足玻璃化形成的需要。在本研究中，冷凍管玻璃化組的正常形態(tài)原始卵泡僅為64.57%，凍存效果顯著低于其他組。Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷凍猴子的卵巢組織，復(fù)溫后約70.4%的卵泡保存正常形態(tài)。本研究中也使用了該方法玻璃化冷凍人卵巢組織，復(fù)溫后形態(tài)學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)約78.36%的原始卵泡保存了正常形態(tài)，低于新鮮組和SSV組；體外培養(yǎng)后，生長(zhǎng)卵泡比例增加，但仍低于新鮮組和SSV組，提示直接微滴玻璃化對(duì)卵巢組織中原始卵泡的形態(tài)及發(fā)育潛能存在一定影響。

固相表面玻璃化法是近年新出現(xiàn)的一種有效、簡(jiǎn)便的玻璃化技術(shù)，曾成功用于玻璃化冷凍牛成熟卵母細(xì)胞[11]和羊卵巢組織[12]。與前述各載體相比，SSV法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：首先，由于該方案是直接將組織置于已經(jīng)在液氮中半懸預(yù)冷至-150～-180℃的固相表面，因而可以避免液氮蒸發(fā)產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致的熱傳導(dǎo)阻滯[13]；其次，SSV技術(shù)與液氮接觸的相對(duì)面積更大，而且可以將冷凍組織所需的冷凍保護(hù)劑減至最少，從而提高降溫速度，促進(jìn)玻璃化的形成[12]。第三，應(yīng)用此方法可以冷凍較大體積的卵巢組織，能在較短時(shí)間內(nèi)完成大量卵巢皮質(zhì)的冷凍保存。第四，在SSV方法中，因直接將載有組織的玻璃態(tài)微滴浸入37℃復(fù)溫溶液中，可以很快復(fù)溫，避免冰晶再形成的發(fā)生從而減少對(duì)組織細(xì)胞的損傷。目前在SSV方法中使用的預(yù)冷的固相表面材料多報(bào)道為鋁箔，主要原因是鋁箔兼具優(yōu)良的導(dǎo)熱性和延展性，且價(jià)格便宜，便于操作。

筆者曾率先將SSV技術(shù)用于保存人卵巢組織，并證實(shí)其冷凍效果與傳統(tǒng)的程序化冷凍效果相當(dāng)。在本研究中，進(jìn)一步將SSV與其他載體（冷凍管、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩）相比，探討對(duì)解凍后卵巢組織中卵泡形態(tài)和體外生長(zhǎng)能力及激素分泌功能的影響。結(jié)果顯示，解凍后，SSV組約有84.70%的原始卵泡維持了正常的形態(tài)，雖稍低于新鮮卵巢組織正常形態(tài)率（約90.27%），但與其他文獻(xiàn)報(bào)道的冷凍后70%～90%的原始卵泡正常形態(tài)率大致相當(dāng)[14-15]。凍融的卵巢組織培養(yǎng)后原始卵泡比例比新鮮未培養(yǎng)組降低，生長(zhǎng)卵泡比例增加。SSV組生長(zhǎng)卵泡比例明顯高于其他玻璃化組，培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮平均濃度亦高于其他玻璃化組。由此證實(shí)SSV技術(shù)比冷凍管、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩作載體有優(yōu)越之處，更適合人卵巢組織的有效玻璃化凍存。

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