多孔細(xì)菌纖維素-聚乳酸乙醇酸-羥基磷灰石復(fù)合支架的制備及性能研究

姚志文 王紅忠 蔡 琛 楊 安 劉 唯 李紅玖 程由勇 李春華 陳治清

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院口腔科，廣東深圳 518104；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔材料教研室，四川成都 610041

組織工程支架材料應(yīng)用時(shí)，單一的材料往往難以同時(shí)滿足生物體對(duì)其力學(xué)強(qiáng)度、親水性、易成型性和生物相容性等多方面的要求，為了盡量同時(shí)滿足這些要求，人們往往通過幾種生物材料的組合來達(dá)到預(yù)期目的。基于這個(gè)思路，本課題選用細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）、聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）和羥基磷灰石（HA）通過溶劑澆鑄/粒子浸出法制備多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架，分析其相關(guān)理化性能，通過體外MG-63細(xì)胞培養(yǎng)，初步評(píng)價(jià)其體外生物相容性及在組織工程中的應(yīng)用可行性。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，上海），CO2培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），LDZ5-2臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），YJ-1450型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司，江蘇），倒置相差顯微照相系統(tǒng)（Olympus，日本），JSM-6360LV電子顯微鏡（EJOL，日本），HTS7000 plus多孔板紫外/熒光/可見光高效分析儀（PE，美國(guó)）。

1.2 主要試劑

高糖 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma，美國(guó)），二甲基亞砜（Sigma，美國(guó)），乙二胺四乙酸（Sigma，美國(guó)），Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），成骨樣細(xì)胞MG-63（四川大學(xué)口腔疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的制備

取1.0 g的PLGA和5 mL氯仿配成溶液，加入經(jīng)過目篩的粒徑為 100～200 μm 的 NaCl晶體 1.0 g和 HA 0.3 g，磁力攪拌和超聲振動(dòng)使其均勻分散。室溫下將以上配好的PLGA溶液倒入底層鋪有BC膜的玻璃皿中。靜置24 h，干燥后PBS液反復(fù)漂洗，冷凍干燥后裁剪成直徑5 mm圓片。25 kGy60Co照射24 h消毒滅菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架相關(guān)理化性能分析

2.1.2.1 表面形貌觀察 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面噴金后放置樣品臺(tái)進(jìn)行掃描電鏡觀察。

2.1.2.2 抗張強(qiáng)度（δb）多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架裁剪成一定的形狀，用千分尺測(cè)其厚度和寬度。使用萬能電子拉力實(shí)驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)公式 δb＝F/A（F：支架的最大拉力，A：支架的截面面積）計(jì)算出支架的抗張強(qiáng)度（δb）

2.1.2.3 孔隙結(jié)構(gòu)測(cè)定 用乙醇裝滿一個(gè)小瓶記錄重量為W1，支架稱重記錄為Ws，然后浸泡于該瓶乙醇中，支架的孔中都充滿乙醇后，瓶子再加滿乙醇，稱重記錄W2，然后把浸滿乙醇的支架取出，剩余乙醇和小瓶稱重記錄為W3，ρ=0.79 kg/m3為乙醇的密度。根據(jù)以下公式計(jì)算孔隙率：

復(fù)合支架本身體積：Vs=（Wl+Ws-W2）/ρ

復(fù)合支架孔體積：Vp=（W2-W3-Ws）/ρ

復(fù)合支架孔隙率：ε=Vp/（Vs+Vp）=（W2-W3-Ws）/（W1-W3）

2.1.3 多孔BC-PLGA復(fù)合支架體外生物相容性分析

2.1.3.1 MG-3細(xì)胞在支架表面的形態(tài)學(xué)觀察 MG-63細(xì)胞從凍存管復(fù)蘇后培養(yǎng)換液，2.5 g/L胰酶常規(guī)傳代，倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)，選取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)5 d后取出標(biāo)本，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，樣本表面噴金后電鏡掃描觀察。

2.1.3.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞在支架材料表面的增殖 MG-3細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BCPLGA-HA復(fù)合支架表面，培養(yǎng)1、3、5 d后各孔內(nèi)分別加入MTT液100 μL，37℃孵育4 h。吸出孔內(nèi)液體后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩 10 min，吸取上清液用酶聯(lián)免疫分光光度計(jì) （490 nm）測(cè)定各孔光吸收值。同時(shí)以MG-3細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板底部作為對(duì)照組。

2.1.3.3 ALP活性檢測(cè) MG-3細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面，培養(yǎng)5 d后取相應(yīng)樣本，提取和制備支架材料上生長(zhǎng)的全部細(xì)胞凍融液，參照ALP試劑盒和Braford試劑盒步驟測(cè)定細(xì)胞勻漿的中蛋白含量和ALP活性。同時(shí)以MG-3細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板底部作為對(duì)照組。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)MTT實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析法，對(duì)ALP檢測(cè)所得數(shù)據(jù)采t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 結(jié)果

2.3.1 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架相關(guān)理化性能分析

2.3.1.1 表面形貌觀察 支架內(nèi)部可見各種裂隙樣或孔洞樣的結(jié)構(gòu)將材料分割為多孔的海綿狀，孔大小為20～200 μm不等，部分孔表面可見覆蓋膜樣結(jié)構(gòu)。10 000倍電鏡下可見粒徑約為幾百納米到幾個(gè)微米形狀不規(guī)則的HA分布在不平整的PLGA膜上。制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架掃描電鏡觀察見圖1、2。

2.3.1.2 抗拉強(qiáng)度結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的抗張強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果為（8.923 1±0.901 2）N/mm2，理論上能夠滿足一定的組織工程支架力學(xué)的要求。

2.3.1.3 孔隙率測(cè)定 在測(cè)定支架的孔隙率時(shí)發(fā)現(xiàn)，所制備的多孔支架沒有發(fā)生明顯的溶脹現(xiàn)象，保持了原來的大小和形貌。本實(shí)驗(yàn)制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的孔隙率測(cè)定結(jié)果為（64.73±5.65）%，提示所得支架具有較好的內(nèi)部貫通結(jié)構(gòu)。

2.3.2 多孔BC-PLGA復(fù)合支架體外生物相容性分析

2.3.2.1 MG-3在支架表面的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)5 d后有一定數(shù)量的細(xì)胞黏附在復(fù)合支架表面并開始增殖（圖3），細(xì)胞與支架表面貼壁緊密，細(xì)胞間以偽足連接，已達(dá)到一定程度的匯合，胞體豐滿，折光較為明顯，部分細(xì)胞已經(jīng)深入到材料表面裂隙中生長(zhǎng)。

2.3.2.2 MG-3在支架材料上的增殖活性檢測(cè) 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，不同實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；不同時(shí)間組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；其中，第1天多孔BC-PLGA-HA組和空白對(duì)照組間光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.217），第 3、5天多孔 BC-PLGA-HA 組的光密度值均高于對(duì)照組（P＜0.005），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MG-3細(xì)胞在多孔BC-PLGA-HA支架材料表面具有更強(qiáng)的增殖活性。MTT法測(cè)定多孔BC-PLGA-HA組和對(duì)照組細(xì)胞的成活和增殖能力結(jié)果見圖4。

2.3.2.3 MG-3在支架材料上的ALP活性檢測(cè) MG-63細(xì)胞在多孔BC-PLGA-HA組和對(duì)照組培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d后，測(cè)定ALP表達(dá)，結(jié)果顯示，多孔BC-PLGA-HA組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.207，P<0.05），表明多孔 BC-PLGA-HA復(fù)合支架材料更有利于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化和成骨活性的表達(dá)。見表1。

表1 成骨樣細(xì)胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

表1 成骨樣細(xì)胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

組別 測(cè)定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度樣品蛋白濃度（gport/L）ALP活性（金氏單位）多孔BC-PLGA-HA組對(duì)照組0.097±0.007 0.017±0.002 0.251±0.005 0.251±0.005 1.48±0.17 1.41±0.03 26.21±0.11 4.33±0.08

3 討論

生物支架是組織工程重要要素之一，對(duì)種子細(xì)胞起到支撐和模板作用，是其附著的基本框架和代謝場(chǎng)所，支架的孔結(jié)構(gòu)形狀、尺寸大小和孔隙率對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖和分化有著很重要的影響，但具體多大孔徑為最佳目前尚未有統(tǒng)一的說法，F(xiàn)reyman等[1]認(rèn)為孔徑為 100～200 μm 較適合細(xì)胞生長(zhǎng)。此外支架的高孔隙率（>90%）和相互貫穿的孔形態(tài)有利于細(xì)胞的種植生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸以及血管和神經(jīng)的內(nèi)生長(zhǎng)，但孔徑和孔隙度的[2]增加同時(shí)會(huì)降低支架的生物力學(xué)強(qiáng)度。

支架材料種類的選擇和制備方法對(duì)支架性能的影響有著重要的影響。本課題將BC、PLGA和HA三種材料通過溶液澆鑄/粒子瀝濾法制備多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架，基于如下考慮：（1）溶液澆鑄/粒子瀝濾法是較為成熟的制備可控孔徑多孔生物支架的方法[3]；（2）HA中有接近正常骨組織鈣/磷比，同時(shí)具有良好的骨傳導(dǎo)性[4]；（3）PLGA降解后在局部積聚的酸性代謝物容易引起無菌性炎癥發(fā)生。HA表面溶解后呈弱堿性，能夠緩沖或中和PLGA降解產(chǎn)生的酸[5]；（4）BC有著良好的理化性能[6-7]：①具有厚度為3～8 nm的納米級(jí)超細(xì)纖維，大小僅為人工合成纖維的1/10；②具有高抗張強(qiáng)度和彈性模量，揚(yáng)氏模量可達(dá)1.5×1010Pa，抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要強(qiáng)5倍；③具有良好的持水性和透氣性能，內(nèi)部有很多“孔道”使其能吸收60～700倍于其干重的水份。預(yù)期BC的加入可以補(bǔ)償材料因降解過程中產(chǎn)生的物理機(jī)械性能下降，從而使復(fù)合支架在修復(fù)功能區(qū)和負(fù)荷區(qū)時(shí)可以較長(zhǎng)時(shí)間地保持良好的力學(xué)性能。本課題選用粒徑為100～200 μm的造孔劑，掃描電鏡觀察制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架呈多孔狀結(jié)構(gòu)，孔形狀略不規(guī)則，大小20～200 μm不等，孔的形狀可能和造孔劑形狀相關(guān)，出現(xiàn)部分較小孔徑原因可能是在篩選造孔劑時(shí)混雜有小部分更小尺寸造孔劑所造成。高倍率下可見粒徑不等的HA散在支架孔的底部。

抗拉強(qiáng)度和孔隙率是衡量生物材料理化性能的兩個(gè)重要指標(biāo)。材料斷裂前所達(dá)到的最大應(yīng)力值稱為抗拉強(qiáng)度，它可以代表材料的部分力學(xué)性能?？紫堵屎筒牧系挠H水性相關(guān)，通?？紫堵试礁?，材料的吸水率就越高，生物相容性就越高。本課題所制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架孔隙率為（64.73±5.65）%，抗拉強(qiáng)度（8.923 1±0.901 2）N/mm2，能夠同時(shí)具有較高的力學(xué)強(qiáng)度和孔隙率，高強(qiáng)度可能來源于BC的本身的優(yōu)良物理機(jī)械性能和支架制備時(shí)PLGA溶液滲透入BC內(nèi)部立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與其牢固結(jié)合有關(guān)，高孔隙率可能和BC本身的高親水性和支架的多孔結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此有望用于修復(fù)人體功能和負(fù)荷區(qū)。

本實(shí)驗(yàn)將成骨樣細(xì)胞MG-3植于多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架上體外培養(yǎng)5天后電鏡掃描結(jié)果顯示：細(xì)胞能夠緊密黏附并有所伸展，達(dá)到一定程度的匯合并已開始增值，表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示培養(yǎng)1 d后多孔BCPLGA-HA組與對(duì)照組組間數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能是因?yàn)樵诮臃N早期MG-3細(xì)胞處于潛伏適應(yīng)期，支架材料對(duì)其增殖的影響作用尚未發(fā)生；培養(yǎng)3～5 d，多孔BC-PLGAHA組細(xì)胞增殖速度明顯快于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在培養(yǎng)5 d后測(cè)量MG-3細(xì)胞內(nèi)ALP的活性發(fā)現(xiàn)：多孔BC-PLGA-HA組細(xì)胞內(nèi)的ALP的合成量明顯高于對(duì)照組。說明多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架更有利于MG-3細(xì)胞的增殖和成骨分化。

綜上所述，本課題采用溶劑澆鑄法制備的多孔BC-PLGAHA復(fù)合支架具有良好的力學(xué)性能、孔隙率和生物相容性，有望作為修復(fù)功能區(qū)和負(fù)載區(qū)的生物材料，為組織工程支架材料提供新的選擇和思路。針對(duì)缺點(diǎn)與不足，實(shí)驗(yàn)在支架的制備、理化性能和生物相容性方面進(jìn)行了初步的探討，有關(guān)復(fù)合支架其他相關(guān)性能、支架成分對(duì)支架本身性能的影響等方面內(nèi)容，還需要進(jìn)更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行分析和討論。

[1]Freyman TM，Yannas IV，Gibson LG.Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering[J].Progress in materials science，2001，46：273-282.

[2]Chang BS，Lee CK，Hong KS，et al.Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations[J].Biomaterials，2000，21（12）：1291-1298.

[3]Mikos AG，Sarakinos G，Vacanti JP，et al.Biocompatible Polymer Membranes and methods of preparation of three dimensional membrane structures[J].United States Patent，1996：122.

[4]Legeros RZ.Properties of osteoconductive biomaterials：calcium phosphates[J].Clin Orthop，2002，395（2）：81-98.

[5]Rezwan K，Chen QZ，Blaker JJ.Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic compositese scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials，2006，27（18）：3413-3431.

[6]Henrik B，Bo R，Paul G.Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft[J].Carbohydrate Polymers，2011，31（1）：14-21.

[7]Magdalena Z，Aase B，Henrik B，et al.Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration[J].Acta Biomaterialia，2010，6（7）：2540-2547.