六味地黃滴心丸總糖含量測定

閆 薈 楊立紅 王蘇會(huì) 張瑞淑

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，北京 100700；2.北京軍區(qū)藥品器材供應(yīng)站，北京 100700；3.北京軍區(qū)司令部門診部，北京 100144

六味地黃滴心丸是六味地黃丸的改進(jìn)劑型，六味地黃是補(bǔ)腎經(jīng)典名方，具有滋補(bǔ)腎陰之功效，常用于治療腎陰不足之證。六味地黃由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮及茯苓六味中藥組成，其每一味藥材中都含有多糖[1-6]。近年研究表明，多糖是其免疫促進(jìn)作用的主要有效成分之一，相對分子量為3萬左右[7]。為此，筆者認(rèn)為對多糖進(jìn)行含量測定有利于保證六味地黃制劑的質(zhì)量。但因多糖組成復(fù)雜，得到對照品較困難，目前多采用單糖如葡萄糖測定樣品中多糖的相對含量，且由于多糖本身無法直接測定，只有水解為葡萄糖后才能測定。為準(zhǔn)確起見，本研究定為測定其總糖含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1201型紫外分光光度計(jì)（北京市通用儀器設(shè)備公司）；AY220型SHIMADZ托盤分析天平（日本島津公司）。

1.2 試藥

六味地黃滴心丸（北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號：090115、090116、090117）；無水葡萄糖對照品（批號：110833-200302）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

參照有關(guān)文獻(xiàn)，總糖含量測定采用蒽酮-硫酸比色法[8-9]，照紫外-可見分光光度法[10]測定。

2.1 供試品溶液的制備

取六味地黃滴心丸20丸，研細(xì)，取1 g，精密稱定，加水100 mL回流提取2次，每次1 h，濾過（用熱水洗滌殘?jiān)?，合并濾液，濃縮，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，定容，搖勻，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖對照品6.25 mg，加純化水于25 mL量瓶中，制成每1 mL含0.25 mg的溶液，溶解，定容，搖勻，即得。

2.3 空白對照溶液的制備

按劑型原輔料的配制比例，精密稱取變性淀粉適量，加水制成空白對照溶液即得。

2.4 蒽酮-硫酸試液的制備

稱取蒽酮0.5 g溶于2 mL乙酸乙酯中，振搖溶解，加入80%硫酸溶液至250 mL，充分振搖溶解，置棕色瓶中密塞備用。

2.5 測定波長的選擇

精密吸取對照品溶液1.0 mL，供試品溶液1.0 mL，分別置干燥具塞試管中，以純化水1.0 mL作空白對照；每管分別加純化水至2.0 mL，再分別精密加入0.2%蒽酮-硫酸試液4.0 mL。立即搖勻，放冷至室溫，顯色后，用紫外分光光度計(jì)于400～800 nm范圍掃描，結(jié)果對照品溶液、供試品溶液顯色后掃描圖譜基本相似，均在625 nm左右有最大吸收，空白對照溶液無吸收，故選擇625 nm作為樣品的測定波長。見圖1。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對照品溶液（0.268 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，各加水至2.0 mL，再加0.2%蒽酮-硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻，放冷至室溫。以試劑為空白，在625 nm處測定其吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=32.257X＋0.001 7，r＝0.999 8。結(jié)果表明葡萄糖濃度在0.005 4～0.026 8 mg/mL范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

2.7 測定方法

精密吸取樣品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，照“2.6”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備進(jìn)行，自“加水至2.0 mL”起操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總糖的含量，計(jì)算，即得。

2.8 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)項(xiàng)下的對照品溶液，按“2.7”項(xiàng)下測定方法，重復(fù)測定6次。見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按“2.7”項(xiàng)下測定方法，分別于 0、30、60、90、120 min測定吸光度，結(jié)果供試品溶液在120 min內(nèi)基本穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果（n=5）

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取六味地黃滴心丸樣品，按“2.7”項(xiàng)下測定方法，重復(fù)測定6份。見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

2.1 1準(zhǔn)確度試驗(yàn)（即回收率試驗(yàn)）

采用加樣回收率試驗(yàn)，取已知含量的樣品6份，分別加入無水葡萄糖對照品200 mg，按“2.7”項(xiàng)下測定方法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總糖的含量，計(jì)算回收率。見表4。

表4 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

2.12 含量測定

取六味地黃滴心丸，按“2.1”供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.7”項(xiàng)下測定方法，測定3批樣品。見表5。

表5 樣品中總糖的測定結(jié)果（n=3）

3 討論

多糖含量的測定方法有苯酚-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelson法、蒽酮-硫酸法等[11]。其中苯酚-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的測定，方法簡單，準(zhǔn)確性較好，靈敏度高，適用面較廣，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色可穩(wěn)定160 min以上[7-9]，但其亦存在缺陷，因苯酚易氧化，見光或遇氧即逐漸氧化成淡紅色，在測定中須避光或操作迅速，只有在穩(wěn)定和熟練的操作情況下才能獲得理想的重現(xiàn)性。

本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法，原理是糖類在硫酸作用下脫水生成糖醛或其衍生物后，與蒽酮試劑迅速而完全地縮合成穩(wěn)定的藍(lán)綠色糖醛衍生物，其生成量與多糖含量存在定量關(guān)系，靈敏度高且快速。蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮-硫酸法測定結(jié)果可能偏高[9]，但蒽酮試劑較穩(wěn)定，且試液在120 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，該方法可以作為六味地黃滴心丸中多糖含量測定的方法。

實(shí)驗(yàn)過程中，在使用硫酸-蒽酮顯色劑時(shí)，由于蒽酮見光易分解，因此，蒽酮-硫酸溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。另外，樣品測定時(shí)，試管中加入蒽酮-硫酸溶液后，由于放熱反應(yīng)試管溫度急劇升高，試管可用自來水沖洗冷卻。

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