電針與鋅合用對(duì)帕金森病模型大鼠一氧化氮、丙二醛等的影響

石 波 楊 蓉 田維珍 劉海霞 孔德祥 劉長金

1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖北荊州 434020；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生理系，湖北武漢 430030

帕金森病（PD）是一種中老年常見的持續(xù)加重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理改變是中腦黑質(zhì)-紋狀體通路中多巴胺（DA）的缺失，臨床表現(xiàn)以肌強(qiáng)直、肢體震顫、運(yùn)動(dòng)減少和姿勢反射障礙等癥狀為主要特征。盡管PD的病因仍不十分清楚，但氧化應(yīng)激過度與自由基毒性對(duì)該病的形成無疑起了重要作用。據(jù)報(bào)道，電針在治療PD模型大鼠和PD患者時(shí)均表現(xiàn)出抗氧化作用[1-3]，為治療PD的安全、有效、經(jīng)濟(jì)的輔助方法[4]。鋅是一種副作用小、價(jià)格便宜的微量元素，是機(jī)體重要的營養(yǎng)素，鋅本身也是一種抗氧化物質(zhì)[5]?，F(xiàn)己證明鋅參與體內(nèi)300余種酶和功能蛋白的組成。另外，鋅還是許多功能蛋白如金屬硫蛋白、核蛋白、受體等的組成成分[6]，鋅具有廣泛的生理和生化功能。因此，筆者通過電針與小劑量鋅合用，試圖了解它們對(duì)PD模型大鼠置質(zhì)超氧化物岐化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的影響，探討它們治療帕金森病的抗氧化協(xié)同作用和潛在機(jī)制以及一種價(jià)廉、安全、有效的新型治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取體重200～250 g成年SD大鼠100只，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證：醫(yī)動(dòng)字第00018516號(hào)）。

1.2 儀器、主要藥物與試劑

腦立體定位儀、疲勞轉(zhuǎn)棒儀、HANS LY257恒流電針儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、執(zhí)筆式牙科鉆（上海江灣醫(yī)療器械廠），XHF-1高速分散器十萬分之一電子天平 （上海金達(dá)生化儀器廠），日立850 model熒光分光光度計(jì)（日本日立公司產(chǎn)），-70℃超低溫冰箱，溫箱及烤箱，光學(xué)顯微鏡（日本島津）；6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司）、戊巴比妥鈉、阿樸嗎啡溶液 （5 mg/2 mL/kg體重），PBS試劑，DAB，TH抗體，ABC試劑盒，MDA、SOD、NO試劑盒，二甲苯，樹脂，硫酸鋅等均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模方法與分組

100只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組（假手術(shù)組或Sham組，每組10只）和模型組（9只）。造模方法：將擬造模大鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，常規(guī)備皮消毒，切開皮膚，將大鼠顱腹臥位居中固定于大鼠腦立體定位儀上。根據(jù)包新民等[7]著大鼠腦立體定向圖譜確定右側(cè)黑質(zhì)定位坐標(biāo)為：前囟后3.5 mm，矢狀線右側(cè)旁開2.5 mm，硬膜下深7.5 mm。標(biāo)記點(diǎn)坐標(biāo)，用執(zhí)筆式牙科鉆鉆透顱骨，牙科探針穿透硬膜。用微量注射器將 4 μL（4 μg/μL）6-OHDA（溶于含 0.2%抗壞血酸的生理鹽水中）注入上述位點(diǎn)各2 μL，緩慢進(jìn)針，注射速度0.5 μL/min，注射完畢留針10 min后，以1 mm/min的速度退針，明膠海綿填塞顱骨孔，顱骨表面局部灑少量青霉素粉劑，縫合皮膚，碘酒擦拭縫合處。假手術(shù)組立體定位下注射等量生理鹽水（內(nèi)含0.2%維生素C）。術(shù)后抗炎3 d。術(shù)后2周，給造模大鼠腹腔注射APO（0.5 mg/kg），誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為，以每分鐘旋轉(zhuǎn)不低于7次者為成功模型。造模前后死亡和不合格31只。除①Sham組外，共將合格模型大鼠59只再次隨機(jī)分為②模型組（MFB組）、③只扎針不通電組（0 Hz組）、④120 Hz電針治療組 （120 Hz組）、⑤120 Hz+鋅組和⑥鋅組。除了MFB組9只，其余每組均為10只。

1.3.2 治療方法

動(dòng)物在同等條件下（室溫20℃，相對(duì)濕度45%）普通飼養(yǎng)。參照華興邦[8]制訂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，120 Hz組、120 Hz+鋅組取百會(huì)、命門穴，用13 mm的毫針針刺，接HANSLY 257恒流電針儀，采用連續(xù)波，頻率為120 Hz，刺激強(qiáng)度以大鼠腿部輕微抽動(dòng)為度（2～6 mA）。每次30 min，每天1次，2周為1個(gè)療程，療程間休息1 d，共治療3個(gè)療程。120 Hz+鋅組和鋅組的飼料中含小劑量硫酸鋅[9]（120 mg鋅/kg飼糧，即在基礎(chǔ)飼料[9]（經(jīng)原子吸收光度計(jì)檢測，含鋅量為20.0 mg/kg）的基礎(chǔ)上以硫酸鋅的形式（100 mg鋅/kg飼糧）添加鋅到飼料中，每只大鼠每天的飼糧量按25 g供給。飼糧一次性配好。Sham組和MFB組不給予治療。

1.3.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.3.1 各組大鼠行為學(xué)檢測 轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)：治療觀察2周后，每隔1周，進(jìn)行行為學(xué)觀察。將大鼠放在轉(zhuǎn)棒上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒，開始計(jì)時(shí)（由計(jì)算機(jī)完成），大鼠為保持平衡而跟隨轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)，逐漸增加轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)，直至大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落，結(jié)束計(jì)時(shí)。從計(jì)時(shí)開始，到大鼠落地計(jì)時(shí)結(jié)束的時(shí)間愈長，大鼠行為學(xué)的改善愈好。

1.3.3.2 各組大鼠右側(cè)黑質(zhì)丙二醛、一氧化氮含量和超氧化物歧化酶活性測定 最后1次行為檢測后迅速處死動(dòng)物，斷頭取腦，置于冰盤上分離右側(cè)黑質(zhì)，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∫话牒谫|(zhì)采用手工勻漿法制成100 g/L組織勻漿，MDA、NO含量和SOD活性的測定均按北京中杉金橋試劑盒說明書步驟，用分光光度計(jì)檢測；另一半用10%的多聚甲醛固定，進(jìn)行黑質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.3.3 取材、切片，光鏡觀察黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化用10%的多聚甲醛固定黑質(zhì)，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水后，TH免疫組化染色步驟按北京中杉金橋ABC試劑盒的說明進(jìn)行。在光鏡下觀察黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量并拍片。結(jié)果判定：經(jīng)染色后TH陽性細(xì)胞胞漿為棕褐色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測試

MFB組和0 Hz組與Sham組相比大鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力明顯減弱（P＜0.05），說明6-OHDA對(duì)MFB組和0 Hz組的大鼠黑質(zhì)造成損害從而影響行為學(xué)；120 Hz組、鋅組和120 Hz+鋅組與MFB組相比，在棒上停留時(shí)間均明顯延長（P＜0.05和P＜0.01），說明一定頻率的電針與鋅均對(duì)行為學(xué)有改善作用，而120 Hz+鋅組在前4周對(duì)行為學(xué)的改善比120 Hz組、鋅組效果更顯著。說明電針與小劑量鋅合用在明顯增強(qiáng)PD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力方面有協(xié)同作用。見表1。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量測定結(jié)果

模型組大鼠黑質(zhì)SOD活性、NO和MDA含量與Sham組比較差異有非常顯著性意義（P＜0.01）。120 Hz+鋅組的以上指標(biāo)與模型組相比具有顯著性意義（P＜0.01）；120 Hz+鋅組與120 Hz組以及鋅組相比，以上指標(biāo)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明電針和小劑量鋅對(duì)帕金森病患者體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)具有調(diào)整作用和協(xié)同調(diào)整作用。見表2。

2.3 光鏡下各實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)黑質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

MFB組和0 Hz組與Sham組比較，黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核固縮 ，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)空泡呈現(xiàn)細(xì)胞早期凋亡的特征；120 Hz組、鋅組和120 Hz+鋅組與MFB組相比，黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元形態(tài)學(xué)明顯改善，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，但與Sham組仍有一定的差距，其中120 Hz+鋅組的黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改善比MFB組和0 Hz組更加明顯（圖1～6在湖北省荊州市中心醫(yī)院病理科完成）。見圖1～6。

表1 各組大鼠第1～6周轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)數(shù)據(jù)（±s，s）

表1 各組大鼠第1～6周轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)數(shù)據(jù)（±s，s）

注：與 MFB 組比較，●P ＜ 0.05，●●P ＜ 0.01；與 Sham 組比較，▲P ＜ 0.05

組別 鼠數(shù) 第1周末 第2周末 第3周末 第4周末 第5周末 第6周末①Sham組②MFB組③0 Hz組④120 Hz組⑤120 Hz+鋅組⑥鋅組10 9 10 10 10 10 128±7 97±5▲109±9 123±9●141±8●●121±10●146±9 107±9▲115±7▲136±11●155±10●●134±8●152±8 113±7▲119±8▲145±7●163±11●●143±11●156±9 118±8▲126±10▲153±11●169±9●●151±7●161±7 123±6▲129±7▲157±10●170±8●155±10●164±6 125±7▲133±6▲159±8●172±10●158±9●

表2 各組大鼠黑質(zhì)超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量的比較（±s）

表2 各組大鼠黑質(zhì)超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量的比較（±s）

注：與 Sham 組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與 MFB 組比較，●P ＜ 0.05，●●P＜ 0.01；與 120 Hz組比較，★P ＜ 0.05

組別 鼠數(shù) SOD（U/mL） NO（mol/L） MDA（mol/mg）①Sham組②MFB組③0 Hz組④120 Hz⑤120 Hz+鋅組⑥鋅組10 9 10 10 10 10 64.4±14.2 48.7±12.6▲49.6±13.4 62.8±11.6●76.0±15.7●●★61.6±12.7●65.5±13.6 33.4±6.8▲▲34.2±15.3 50.3±14.2●●57.3±13.0●●43.0±16.1●4.6±2.7 7.8±4.1▲▲7.4±3.0 4.8±3.1●●3.7±2.9●●★5.2±2.8●●

3 討論

帕金森病是一種老年病，隨著年齡的增高，MDA的含量增加、SOD活性下降，體內(nèi)清除自由基的防御功能日趨衰退，導(dǎo)致自由基增多，過多的自由基可使神經(jīng)細(xì)胞老化和數(shù)量大量減少而導(dǎo)致PD的發(fā)病[2-3]。本實(shí)驗(yàn)造模后，帕金森病大鼠因缺血缺氧，引起細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，釋放大量的自由基，消耗大量的NO，導(dǎo)致SOD活性降低，產(chǎn)生大量的MDA。與模型組比，120 Hz組、鋅組以及120 Hz+鋅組治療后，SOD活性明顯增強(qiáng)，NO顯著增加，MDA明顯減少。120 Hz+鋅組與120 Hz組、鋅組比較，抗氧化作用明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。SOD能清除多巴胺經(jīng)氧化代謝產(chǎn)生的H2O2，使多巴胺神經(jīng)元免受氧化損傷，對(duì)機(jī)體預(yù)防和阻礙PD的發(fā)生和發(fā)展起到積極的神經(jīng)保護(hù)和治療作用[2-3]。腦和神經(jīng)原產(chǎn)生的NO可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，起細(xì)胞間信使作用和神經(jīng)遞質(zhì)作用。腦內(nèi)NO具有松弛平滑肌、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集及減輕細(xì)胞毒的作用[2，10]。本實(shí)驗(yàn)中，120 Hz組、鋅組、以及120 Hz+鋅組經(jīng)治療均能明顯改善PD動(dòng)物的行為，尤以120 Hz+鋅組更為明顯。電針對(duì)PD大鼠黑質(zhì)細(xì)胞通過增加抗氧化酶系統(tǒng)的作用，調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的各種內(nèi)在保護(hù)機(jī)制[2-3，11]?？寡趸⒘吭劁\參與抗氧化酶的重要構(gòu)成，同時(shí)本身也具有抗氧化功能。鋅具有穩(wěn)定超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)，鋅可與過渡金屬離子（Fe2＋等）競爭，使H2O2不能轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的羥自由基，減少過氧化脂質(zhì)（LPO）的生成，增加機(jī)體消除自由基的能力，保護(hù)生物膜[12]。鋅還可通過保護(hù)巰基抗氧化和抑制活性氧產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化作用[5]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，電針以及飼料中加鋅后，機(jī)體抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，且電針與小劑量鋅聯(lián)合應(yīng)用比各自單獨(dú)用的效果更好，說明鋅在一定程度上可加強(qiáng)電針的抗氧化作用。同時(shí)電針和鋅均可調(diào)節(jié)腦內(nèi)遞質(zhì)，使黑質(zhì)紋狀體內(nèi)興奮性和抑制性的兩種遞質(zhì)處于平衡狀態(tài)，從而維持正常運(yùn)動(dòng)機(jī)能，改善行為學(xué)[13-15]。120 Hz+鋅組黑質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)量和形態(tài)與模型組比有顯著改善，大量的壞死細(xì)胞和萎縮神經(jīng)元得到修復(fù)，與電針和鋅的抗氧化作用密切相關(guān)。

綜上所述，電針與小劑量鋅合用對(duì)PD大鼠在增強(qiáng)SOD活性、增加NO和減少M(fèi)DA含量以及保護(hù)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元方面均具有協(xié)同效應(yīng)。電針與小劑量鋅合用對(duì)PD大鼠的治療作用與它們調(diào)整體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)。但本研究中與電針合用的鋅劑量是否是最佳劑量，多少劑量的鋅與電針合用對(duì)PD的防治既安全又能發(fā)揮最好的效果以及它們的治療時(shí)間和作用機(jī)制還有待深入研究。

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