VEGF-siRNA在腎癌中的實(shí)驗(yàn)研究

隋玉東 王曉民 楊德君 王科亮

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬四院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001

腎癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，在治療上通常采用的是手術(shù)治療，但是在早期診斷時(shí)有大約30%的患者存在轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，其轉(zhuǎn)移的主要方式是血道轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是涉及很多因子的復(fù)雜過程，研究發(fā)現(xiàn)有很多因子參與轉(zhuǎn)移過程，最值得關(guān)注的是血管內(nèi)皮生長因子VEGF，其是通過旁分泌的方式釋放，從而刺激腫瘤血管的生成，加快腫瘤的生長，VEGF不僅加快血管生長速度，也增加血管的通透性，F(xiàn)errara等[2]報(bào)道中提及腎癌的腫瘤的生長是通過自分泌和有通透性的作用。為了減少腎癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤的生長速度，采用了對(duì)siRNA和血管內(nèi)皮生長因子的研究，探討腎癌的治療前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)體外過程

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 腎癌細(xì)胞786-0由實(shí)驗(yàn)室自身提供，siRNA的設(shè)計(jì)：在Gene Bank查找編碼人VEGF cDNA的序列，應(yīng)用Ambion公司RNAi設(shè)計(jì)軟件并參考有關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行全基因組掃描和序列同源分析，設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶點(diǎn)，上述由廣東銳博合成所需的編碼RNA，然后由該公司轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒中。

1.1.2 方法 siRNA的合成：廣東銳博根據(jù)提供參考的堿基對(duì)5′-GATCCACCTCACCAAGGCCAGCACTTCAAGAGAGTGCTG GCCTTGGTGAGGTTTTTTTTGGAAGTCGACA-3′（有義鏈）；3′-GTGGAGTGGTTCCGGTCGTGAAGTTCTCTCACGACCGGAA CCACTCCAAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5′，合成目的 siRNA。

1.1.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)和提取 由廣東銳博根據(jù)堿基序列合成所需的質(zhì)粒，并由廣東銳博將質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌中，再放進(jìn)搖箱進(jìn)行搖晃，觀察甘油菌的生長情況，同時(shí)加氨芐西林將非耐藥的大腸桿菌殺死，使其含目的質(zhì)粒的基因在大腸桿菌內(nèi)大量繁殖。然后將質(zhì)粒提取檢測質(zhì)粒，加入甘油進(jìn)行保存。

1.1.4培養(yǎng)細(xì)胞 將實(shí)驗(yàn)室提供的腎癌786-0細(xì)胞系放置于人工培養(yǎng)液血清1640中，每24小時(shí)更換培養(yǎng)液，置于37℃溫箱中進(jìn)行繁殖、傳代，凍存以備后期使用。

1.1.5 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞進(jìn)行分組，分為空白組、目的組、含空質(zhì)粒組、其他干擾因子組四組，轉(zhuǎn)染前24 h，進(jìn)行細(xì)胞準(zhǔn)備，實(shí)驗(yàn)前24 h接種細(xì)胞，每孔細(xì)胞0.8×105個(gè)，密度為50%，第2天細(xì)胞密度增加至75%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.1.6 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染是否成功 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，挑選狀態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行熒光下顯像，觀察細(xì)胞的形態(tài)以及分析是否轉(zhuǎn)染成功，也可以通過RT-PCR技術(shù)檢測是否轉(zhuǎn)染成功。在圖1中可以看出轉(zhuǎn)染后的腎癌細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，在熒光顯微鏡下能夠看出熒光梭行腎癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完好，熒光顯色均勻，未見腎癌細(xì)胞的破裂，轉(zhuǎn)染成功。

1.1.7 WESTER-BLOT 此步驟是為了檢驗(yàn)蛋白產(chǎn)生，具體步驟如下：①先將細(xì)胞在超聲下均漿破碎；②加入1.5 mL的裂解液，震蕩混勻，冰上孵育30 min，離心，將上清液棄去，加入Nonidet P40至濃度0.6%，搖勻，冰上孵育10 min，將沉淀懸浮于0.5 mL的loadingbuffer中，樣品在冰上孵育30min，2000 r/min，4℃下離心10 min，將沉淀的蛋白分裝，保存。將等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-J聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以濕轉(zhuǎn)法移到NC膜上，轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移條件為電流1 A，將時(shí)間調(diào)制1 h，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3%BSA室溫封閉3 h，加入適當(dāng)稀釋的一抗，在4℃下過夜，用洗滌液buffer洗膜3遍，加入相應(yīng)的二抗，在37℃下反應(yīng)2 h，洗膜，以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應(yīng)。在圖2中能夠清楚看見，在蛋白電泳中出現(xiàn)蛋白條帶陽性，間接表示轉(zhuǎn)染后的腎癌細(xì)胞中有轉(zhuǎn)染后VEGF蛋白表達(dá)。

1.1.8 細(xì)胞生長曲線 將腎癌細(xì)胞786-0制成細(xì)胞懸液接種于96孔板上，每孔濃度1×107/L，24 h后更換培養(yǎng)液，同時(shí)加入不同濃度的siRNA，每隔24 h取3孔做細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.1.9 CCK-8法 很多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT方法，但是CCK-8在實(shí)驗(yàn)中具有簡便、安全、精確的優(yōu)點(diǎn)。步驟：接種細(xì)胞懸液于96孔板內(nèi)，經(jīng)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，再分別加入不同濃度的Ki67 siRNA,，每一濃度做3個(gè)復(fù)孔，并以negative siRNA和空白做對(duì)照，37℃下5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，有另外幾孔已知數(shù)量的活細(xì)胞以備制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將CCK-8試劑解凍，每孔加入10 μL，注意不能有氣泡，放置培養(yǎng)箱4 h。用酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長的吸光度，參照對(duì)照比630 nm波長。根據(jù)公式抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照A值）×100%計(jì)算抑制率。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 小鼠分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c分組：給予正常的18只小鼠正常喂養(yǎng)，然后將小鼠標(biāo)有數(shù)字，寫在卡片上，放在暗箱中隨機(jī)分組，將其分為3組，分別是目的組（VEGF），綠色熒光組（GPF），空質(zhì)粒組（Control），每組 6 只小鼠，將小鼠進(jìn)行同樣飲食飼養(yǎng)，飼養(yǎng)天數(shù)為21 d。然后將體外培養(yǎng)好的帶有目的基因的腎癌細(xì)胞，配制密度1.0×107個(gè)/mL，在每只小鼠的背部皮下注射細(xì)胞懸液約0.3 mL，然后正常喂養(yǎng)小鼠，其他兩組依次按此法喂養(yǎng)。

1.2.2 計(jì)算測量腫瘤大小 觀察瘤體體積：在正常飼養(yǎng)小鼠的情況下，每隔1 d用卡尺測量最大直徑的長度A和與之垂直的最大寬徑B，利用公式得出相應(yīng)結(jié)果，比較各組小鼠的生長情況，繪制腫瘤的生長曲線。

1.2.3 測量血管密度 病理形態(tài)觀察和免疫組化檢測VEGF表達(dá)、血管密度。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取出腫瘤組織，應(yīng)用常規(guī)HE染色，觀察組織變化，用兔抗鼠VEGF作為一抗，按照說明進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色，隨機(jī)在腫瘤的邊緣與正常組織取平均值MVD，計(jì)算與同視野下的腫瘤細(xì)胞總數(shù)均值的比值，作為腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)陽性率MVD技術(shù)按Weidner評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本之間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF的陽性率

在目的組（VEGF）、綠色熒光組（GPF）、空質(zhì)粒組（Control)的腎癌細(xì)胞中，應(yīng)用免疫熒光法檢測VEGF在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，在綠色熒光組（GPF）中和空質(zhì)粒組陽性率很高，在目的組中很低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 腫瘤生長曲線

含有VEGF的小鼠的背部的腫瘤體積隨著時(shí)間的增長，三組小鼠的背部腫瘤的大小不一，在同一時(shí)間點(diǎn)上相比含有VEGF的小鼠腫瘤體積最小，VEGF組與GPF組、對(duì)照組相比，腎腫瘤的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組和GFP組，對(duì)照組和GPF組相比，其腫瘤體積差異不大。見圖3。

2.3 組織中血管密度

在三組小鼠中，通過SABC法免疫組織化學(xué)染色顯示，在VEGF組中血管密度比其他兩組在同期中都低，在對(duì)照組中血管密度最高，GPF組介于VEGF組和對(duì)照組之間，在同組中每只小鼠的血管密度變化不大，說明siRNA-VEGF在腎癌中具有抑制腫瘤生長的效果。見表1。

表1 組織中血管密度（個(gè)/mm2）

3 討論

腎癌的治療在臨床上比較單一，主要是通過手術(shù)治療，對(duì)放化療不敏感免疫治療在腎癌晚期治療效果不理想。近幾年通過對(duì)腎癌的研究，臨床上有許多藥物誕生，但價(jià)格比較昂貴，患者不能承受，筆者通過將si-RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)腎癌細(xì)胞內(nèi)，與Control組和GFP組相比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞比Control組和GFP組生長緩慢，將三組含有不同質(zhì)粒的腎癌細(xì)胞皮下種植小鼠皮下，建立動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑴y量三組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍[瘤的直徑大小，可以直觀發(fā)現(xiàn)存在siRNA的腎癌的小鼠生長速度明顯低于Control組和GFP組，生長速度也明顯低于其他兩組，Control組和GFP的體積大小以及生長速度明顯高于VEGF組。GFP組的生長速度和在體小鼠的腫瘤大小無明顯變化，通過免疫組化測量組織血管密度可以看出，三組小鼠組織的血管密度各不相同，其表現(xiàn)差異性很大，在VEGF組中，6只小鼠的血管密度與GFP組、Control組相比均小。在VEGF組的每只小鼠的組織血管密度相差不大，這與siRNA抑制血管內(nèi)皮生長有很大關(guān)系，說明其能抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長的速度，間接抑制腫瘤的生長速度，直觀上可見腫瘤大小以及體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于GFP組和Control組。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)研究，筆者可以得出siRNA-VEGF具有抑制腎癌細(xì)胞的生長作用，為臨床起到指導(dǎo)作用，在藥物的研發(fā)上起指導(dǎo)作用。

血管內(nèi)皮生長因子屬于多潛能因子家族，VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子VEGF的生物學(xué)作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮生長，增加血管的通透性及血管生成維持其功能，此外還有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂[3]。最后還有細(xì)胞質(zhì)的聚鈣作用在正常腎臟可以表達(dá)，其含量和病變的程度呈正比[4]。

腫瘤的生長依賴血管以及生長因子的作用，其中VEGF對(duì)血管的生長有很大的作用，是決定血管形成的因素之一[5]。VEGF在許多惡性腫瘤組織中高水平表達(dá)，腫瘤組織中的高表達(dá)VEGF有利于腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，有很多研究顯示腫瘤生長組織中VEGF的表達(dá)很高[6-7]。在實(shí)驗(yàn)中Control組腫瘤細(xì)胞生長很快，而在VEGF組腎癌組織生長很慢，血管密度很低，說明VEGF的表達(dá)增高與腎癌的生長與侵襲有關(guān)。

腎癌是一種很容易轉(zhuǎn)移的腫瘤，在臨床上往往轉(zhuǎn)移發(fā)生很早，轉(zhuǎn)移的主要方式是淋巴轉(zhuǎn)移和血道轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移是一個(gè)很復(fù)雜的過程，也是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很多因子參與調(diào)控，幾近年來發(fā)現(xiàn)VEGF是與實(shí)體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有很大聯(lián)系的一組生長因子，是以旁分泌的形式進(jìn)行分泌，刺激血管形成，間接促進(jìn)腫瘤的生長，在腫瘤的生長體積以及晚期轉(zhuǎn)移的患者VEGF的表達(dá)水平高于早期患者。Oya等[8]報(bào)道，腎臟小血管以及小管是通過VEGF子分泌作用促進(jìn)瘤的增生。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF與相應(yīng)的疾病有關(guān)聯(lián)，例如腎衰竭、代謝疾病、血管疾病，在不同的腎臟疾病中VEGF的表達(dá)不同。但是現(xiàn)在在腎癌的研究中，確定VEGF起著決定性的作用，現(xiàn)在有應(yīng)用藥物的治療，例如舒尼替尼、索拉菲尼等藥物的治療。應(yīng)用藥物在最大限度上抑制VEGF和擴(kuò)大潛在的抗腫瘤作用，現(xiàn)對(duì)這些藥物組合安全性進(jìn)行評(píng)估，所以不難看出，在發(fā)現(xiàn)VEGF之后為臨床治療提供了指導(dǎo)思想，為尋找其他有效因子作出了很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在今后腎癌治療中有很好的指導(dǎo)意義。

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