缺氧應(yīng)激對(duì)HepG-2細(xì)胞AFP和ICAM-1表達(dá)的影響

盧根林，鄧 勇，閆興軍

（1.義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏322000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧810001）

缺氧應(yīng)激對(duì)HepG-2細(xì)胞AFP和ICAM-1表達(dá)的影響

盧根林1，鄧 勇2，閆興軍1

（1.義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏322000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧810001）

目的：探討缺氧應(yīng)激對(duì)HepG-2細(xì)胞甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和細(xì)胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1表達(dá)的影響。方法：缺氧（5%O2、5%CO2、90%N2）和常氧培養(yǎng) HepG-2細(xì)胞。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定HepG-2細(xì)胞侵襲能力；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)測(cè)定常氧組和缺氧12、24h組 HepG-2細(xì)胞AFPmRNA和ICAM-1mRNA的表達(dá)量。流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定ICAM-1蛋白表達(dá)，放射免疫法測(cè)定HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)上清AFP蛋白表達(dá)。結(jié)果隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HepG-2細(xì)胞的侵襲能力、增殖活性、AFP、ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。結(jié)論：缺氧應(yīng)激下人HepG-2細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)的機(jī)制之一是ICAM-1基因表達(dá)上調(diào)；HepG-2細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)的機(jī)制之一是HepG-2細(xì)胞AFP基因的表達(dá)上調(diào)。

缺氧應(yīng)激；HepG-2細(xì)胞；甲胎蛋白；細(xì)胞間粘附分子-1

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的生物學(xué)過程，其發(fā)生有賴于腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)、不同時(shí)相細(xì)胞粘附與解粘附、降解并穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)［1］。實(shí)體瘤存在著缺氧的局部微環(huán)境，缺氧時(shí)腫瘤細(xì)胞增殖活性、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，糖酵解途徑上調(diào)、對(duì)化療藥物耐藥性增強(qiáng)，對(duì)放療敏感下降［1］。本研究模擬肝癌缺氧微環(huán)境，探討缺氧應(yīng)激對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞侵襲能力和增殖活性和AFP、ICAM-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG-2引自蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科（來源于美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所），胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，MTT、DMSO和胰蛋白酶均為美國(guó)Sigma產(chǎn)品，RT-PCR Kit購(gòu)于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品。人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、AFP和ICAM-1基因聚合酶鏈反應(yīng)引物序列如下：β-actin上游引物 5′-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3′，下游引物 5′-ATCCACACGGAGTACTTGCGCTCA-3′，目的片段長(zhǎng) 度 為600bp；AFP 上游引物 5′-GTTCCAGAACCTGTCACAAG-3′，下 引 物 5′-CTTTGTTTGGAAGCATTCAACTGC-3′，目的片段長(zhǎng)度為 193bp；ICAM-1 上游引物 5′-TGGTAGCAGCCGCAGTCATA-3′，下引物 5′-CTCCTTCCTGGCTTAGT-3′，目的片段長(zhǎng)度為377bp；由Invitrogen公司合成。兔抗人 ICAM-1多克隆抗體，羊抗兔IgG-FITC熒光標(biāo)記二抗均購(gòu)自武漢博士德公司，AFP試劑盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人HepG-2細(xì)胞置滅活10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-5天傳代一次。缺氧12、24小時(shí)組 HepG-2細(xì)胞置37℃、5%O2、5%CO2、90%N2三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 12、24h。

1.3 HepG-2細(xì)胞增殖活性檢測(cè)［2］

用四甲基偶唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化，設(shè)置無細(xì)胞孔做空白對(duì)照，置Bio-Tek酶標(biāo)儀上選擇490nm波長(zhǎng)讀吸光度（A），各孔的A值=各孔所測(cè)A值-空白對(duì)照孔所測(cè)A值。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)［3］

Matrigel（30μg/孔）鋪于Transwell小室8μm聚碳酸酯微孔濾膜上、過夜干燥并水化Matrigel。Transwell上室為2×105個(gè)HepG-2細(xì)胞（細(xì)胞活力＞95%），下室為含 10μg/ml Fibronectin完全培養(yǎng)基600μl，每組設(shè) 6 個(gè)平行孔，37℃常氧或缺氧孵育12h、24h。取出 Transwell小室，PBS洗 2次，用滅菌棉簽擦去濾膜上表面未穿膜的細(xì)胞和Matrigel，95%酒精固定15分鐘，HE染色，隨機(jī)選擇10個(gè)100×視野并計(jì)數(shù)。

1.5 各組HepG-2細(xì)胞AFP、ICAM-1mRNA表達(dá)

Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，電泳見28S、18S條帶，以 2.5μg總 RNA為模板，以 Takara公司的Random Premier為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。AFP和β-actin PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘后，95℃ 變性 30s、60℃退火 30s、72℃延伸 50s共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。ICAM-1和β-actin PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘后，95℃ 變性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸50秒共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以 AFP/β-actin和 ICAM-1/β-actin值分別表示AFP、ICAM-1 mRNA含量。

1.6 各組HepG-2細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)

1.6.1 培養(yǎng)細(xì)胞和取樣取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)接種于6孔板，常氧組HepG-2細(xì)胞于常氧培養(yǎng)24小時(shí)；缺氧12、24小時(shí)組HepG-2細(xì)胞于缺氧培養(yǎng)12、24小時(shí)，收集細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次，用75%冷乙醇（4℃）固定，4℃保存。

1.6.2 采用免疫熒光間接法 檢測(cè)細(xì)胞前經(jīng)1500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，PBS洗滌2次，加20μl（1：20）兔抗人ICAM-1抗體，37℃水浴30分鐘，PBS洗滌2次，加20μl（1：50）羊抗兔IgG-FITC熒光標(biāo)記二抗，另設(shè)不加ICAM-1抗體只加IgGFITC熒光標(biāo)記二抗作為空白對(duì)照組，37℃水浴30分鐘，PBS洗滌2次，4℃保存，待測(cè)。

1.6.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 采用美國(guó)Becton-Dickson公司的FACSan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每樣品收集1×105個(gè)細(xì)胞，用 Clifit軟件進(jìn)行分析，參照Morkve［4］等提出的熒光指數(shù)（Fluorescence index，F(xiàn)I）表示ICAM-1蛋白的相對(duì)含量。

1.7 各組HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)上清AFP含量的測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，常氧組HepG-2細(xì)胞于常氧培養(yǎng)24小時(shí)；缺氧12、24小時(shí)組HepG-2細(xì)胞于缺氧培養(yǎng)12、24小時(shí)；吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)1000rpm離心15分鐘，取上清用于AFP含量的RIA檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HepG-2細(xì)胞AFP、ICAM-1mRNA表達(dá)

常氧組和缺氧12h、24小時(shí)組總RNA的28S/18S=2：1，表明所提取的總RNA完整性好，可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。圖1、2和表1示：隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HepG-2細(xì)胞的AFP、ICAM-1 mRNA表達(dá)量明顯增高（P＜0.01），兩者正相關(guān)（r=0.754，P＜0.05）。提示缺氧應(yīng)激上調(diào) HepG-2細(xì)胞 AFP、ICAM-1 mRNA表達(dá)。

2.2 HepG-2細(xì)胞AFP、ICAM-1蛋白表達(dá)

隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HepG-2細(xì)胞的AFP、ICAM-1蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.01），兩者正相關(guān)（r=0.769，P＜0.05）。提示缺氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細(xì)胞 AFP、ICAM-1蛋白表達(dá)（見表1）。

表1 缺氧應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞ICAM-1及AFP分子表達(dá)的影響（N=6，±SD）

表1 缺氧應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞ICAM-1及AFP分子表達(dá)的影響（N=6，±SD）

注：*：與常氧組比較P＜0.01；#：與缺氧12h組比較 P＜0.01

值）常氧組 0.037±0.001 0.51±0.02 26.17±3.38 0.42±0.05 55±5 0.26±0.01缺氧12h組 0.051±0.002* 0.68±0.03* 44.25±3.87* 0.52±0.05* 67±4* 0.30±0.01*缺氧24h組 0.080±0.002*# 0.84±0.03*# 52.70±4.03*# 0.59±0.06*# 91±3*# 0.37±0.02*#組別 ICAM-1蛋白表達(dá)ICAM-1mRNA表達(dá)AFP蛋白表達(dá)（ng/ml） AFPmRNA表達(dá) 侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)/HP）增殖活性（A

2.3 缺氧應(yīng)激下HepG-2細(xì)胞增殖活性的改變

表1顯示：隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HepG-2細(xì)胞的增殖活性明顯增高（P＜0.01）。HepG-2細(xì)胞增殖活性與 AFP蛋白及 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.691、0.781，P ＜0.01）。

2.4 缺氧應(yīng)激下HepG-2細(xì)胞侵襲力的改變

表1顯示：隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HepG-2細(xì)胞的侵襲能力明顯增高（P＜0.01）。侵襲力和ICAM-1蛋白及mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.742、0.754，P ＜0.01）。

圖1 HepG-2細(xì)胞AFP mRNA表達(dá)

圖2 HepG-2細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)

圖3 A、B、C分別表示常氧、缺氧12h、24hHepG-2細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)

3 討 論

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的生物學(xué)過程，其發(fā)生有賴于腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)、不同時(shí)相細(xì)胞粘附與解粘附、降解并穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)［1］。實(shí)體瘤存在著缺氧的局部微環(huán)境，缺氧時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成異二聚體HIF-1，HIF-1與其靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）5′-ACGTGC-3′結(jié)合，上調(diào)靶基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞增殖活性、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，糖酵解途徑上調(diào)、對(duì)化療藥物耐藥性增強(qiáng)，對(duì)放療敏感下降［1］。前期的研究表明缺氧應(yīng)激下 HepG-2細(xì)胞HIF-1表達(dá)［2］。本研究顯示：缺氧應(yīng)激下人HepG-2細(xì)胞的侵襲能力、增殖活性增強(qiáng)，與文獻(xiàn)［1］相一致。

AFP基因?qū)儆诎椎鞍谆蚣易?，?個(gè)增強(qiáng)子，是原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷的重要血清標(biāo)記物，參與細(xì)胞增殖和代謝的調(diào)節(jié)，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［5］。研究表明沉默AFP啟動(dòng)子抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性［6］。本實(shí)驗(yàn)顯示：缺氧應(yīng)激下人 HepG-2細(xì)胞AFP基因的表達(dá)上調(diào)，增殖活性增強(qiáng)，且兩者呈正相關(guān)；提示缺氧應(yīng)激下HepG-2細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)的機(jī)制之一是HepG-2細(xì)胞AFP基因的表達(dá)上調(diào)。

人ICAM-1（又名 CD54）基因長(zhǎng) 15.5Kb，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，定位于染色體19p13.2-13.3區(qū)，編碼由4個(gè)前后排列的免疫球蛋白樣區(qū)域組成的糖蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞間識(shí)別和粘附的重要粘附分子［7］。曲增強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)：ICAM-1基因是肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)志物之一。ICAM-1高表達(dá)的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，其可能的機(jī)制是：高表達(dá)ICAM-1的肝癌細(xì)胞通過LFA-1與浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞緊密結(jié)合，肝癌細(xì)胞間粘附力降低，易于隨淋巴細(xì)胞的遷移脫離母瘤，與淋巴細(xì)胞結(jié)合的肝癌細(xì)胞在穿越血管壁時(shí)可以免受傷害，在血循環(huán)中易于形成栓子，逃逸免疫監(jiān)視，易于在毛細(xì)胞血管內(nèi)或淋巴竇滯留，形成轉(zhuǎn)移灶［8］。本實(shí)驗(yàn)顯示：缺氧應(yīng)激下人HepG-2細(xì)胞ICAM-1基因的表達(dá)上調(diào)，侵襲力增強(qiáng)，與 Indovina［9］結(jié)果一致。ICAM-1 基因表達(dá)與HepG-2侵襲力呈正相關(guān)；提示缺氧應(yīng)激下HepG-2細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)的機(jī)制之一是HepG-2細(xì)胞ICAM-1基因的表達(dá)上調(diào)。

AFP、ICAM-1基因表達(dá)正相關(guān)，與 Zhang等［10］研究結(jié)果一致，提示兩者可能在缺氧應(yīng)激下HepG-2細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)中起協(xié)同作用，有待于進(jìn)一步研究明確。AFP、ICAM-1基因是否是HIF-1的靶基因，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effects of hypoxia stress on expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell

LU Genlin1，DENG Yong2，YAN Xingjun1
（1.Yiwu Central Hospital，Zhejiang 322000，China；2.the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810001，China）

ObjectiveTo investigate whether hypoxia stress regulates expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell.MethodHepG-2 cells were cultured under hypoxia（5%O2，5%CO2and 90%N2）for 12，24 h or normoxia.The proliferation in HepG-2 cell was detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）.Cell invasion and migration assay was used to decide the invasion in HepG-2 cell.The expressions of AFP and ICAM-1 mRNA in HepG-2 cell were determined by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expression of ICAM-1 protein in HepG-2 cell was studied by flow cytometry assay.The expression of AFP protein in HepG-2 cell was determined by radio-immunity assay（RIA）.ResultWith the hypoxia time extending，the expressions of AFP and ICAM-1 gene were dramatically enhanced（P＜ 0.01）.ConclusionUp-regulation of AFP and ICAM-1 contributes to the enhancement of proliferation，invasion in HepG-2 cell by hypoxia stress respectively.

hypoxia stress；HepG-2 cell；AFP；ICAM-1

R364.4；R73-37

A

1672-0024（2012）01-0044-04

盧根林（1973-），男，浙江衢州人，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：普通外科學(xué)

青海省衛(wèi)生廳2006年指導(dǎo)性科研項(xiàng)目（編號(hào)：200601）