硫脲殼聚糖Zn(II)配合物的制備、表征及生物活性

馮小強(qiáng)，李小芳，楊 聲，張景峰

天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水741001

硫脲殼聚糖Zn(II)配合物的制備、表征及生物活性

馮小強(qiáng)*，李小芳，楊 聲，張景峰

天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水741001

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，對(duì)合成的硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物進(jìn)行了表征，研究了殼聚糖、硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物對(duì)細(xì)菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能。結(jié)果表明:合成的硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能比單一的殼聚糖、硫脲殼聚糖顯著提高，對(duì)真菌黑曲霉亦具有較強(qiáng)的抑制作用。

殼聚糖;硫脲殼聚糖-Zn(II)配合物;制備;抑菌性能

Abstract:Thiourea-chitosan-Zn(II)complex was prepared and characterized by FT-IR，UV-Vis absorbance spectra，XRD and TG-DTA methods.The antimicrobial activities of chitosan，thiourea-chitosan and thiourea-chitosan-Zn(II)complex against Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Aspergillus niger were investigated in vitro.The results showed that the antimicrobial activity of thiourea-chitosan-Zn(II)complex obviously enhanced compared to the chitosan and thiourea-chitosan，which can effectively inhibit the growth of Aspergillus niger.

Key words:Chitosan;Thiourea-chitosan-Zn(II)complex;Preparation;Antimicrobial activity

殼聚糖(Chitosan，簡(jiǎn)稱CS)具有無(wú)毒、生物相溶、可降解、抑菌等特性，在醫(yī)學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、輕工業(yè)等領(lǐng)域有著極為廣泛的應(yīng)用。與一般抑菌劑相比，它具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高和無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)［1］。由于殼聚糖分子鏈中有大量羥基、氨基及N-乙酰氨基，這種特殊的結(jié)構(gòu)使殼聚糖通過(guò)氫鍵或鹽鍵形成具有類(lèi)似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，從而對(duì)金屬和稀土離子有著穩(wěn)定的配位作用。硫脲化合物螯合金屬非常有效，廣泛應(yīng)用于金屬的提?。?］。殼聚糖新型衍生物硫脲殼聚糖對(duì)金屬離子亦有著穩(wěn)定的配位作用，并且金屬離子具有抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血等藥理作用［2］，形成的配合物以期為高活性的抗菌劑。

對(duì)于硫脲殼聚糖與金屬離子配合物的研究不多。Chen等發(fā)現(xiàn)硫脲殼聚糖中的S原子和O原子參與了與Ag+的配位，且硫脲殼聚糖-Ag+具有很強(qiáng)的抑菌活性，最小抑菌濃度較殼聚糖降低20倍［4］。本實(shí)驗(yàn)合成了硫脲殼聚糖(TUCS)，選擇了金屬離子Zn2+與 TUCS配位，采用 FT-IR、UV、DG-DTA 和XRD分析手段，并對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能進(jìn)行了比較研究。該研究為CS及其衍生物的臨床應(yīng)用提供更加充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并擴(kuò)大了CS在醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

殼聚糖(浙江玉環(huán)殼聚糖有限公司，Mw=50 kDa，DD.90%)，用 1.0%(v/v)HAc 溶解。大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 35218)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 26113)、黑曲霉(Aspergillus niger)均由天水市中醫(yī)院化驗(yàn)科提供。

UV-9200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);Spectrum One傅立葉紅外光譜儀(Perkin Elmere);Perkin Elmere TG-DTA分析儀(Pyris Diamond Analyzer)。

1.2 TUCS 的制備

將3.4 g的硫脲和3.0 g CS及30 mL的無(wú)水乙醇加入到三頸燒瓶中，溫度控制在65℃，回流攪拌12 h，產(chǎn)物冷卻至室溫，過(guò)濾、反復(fù)用乙醇洗滌，將過(guò)濾物溶解于100 mL的1%(v/v)乙酸溶液，加入10%(w/v)氫氧化鈉溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集沉淀，用水洗凈、干燥，得到 TUCS，產(chǎn)率為 85%［4］。

1.3 TUCS-Zn配合物的制備

在裝有0.5 g TUCS的錐形瓶中加入40 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%的乙酸溶液，在水浴振蕩器中振蕩1 h，待 TUCS 充分溶解后，加入0.1 g ZnCl2，用10%的HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，控溫反應(yīng)4 h后，加入200 mL丙酮溶液析出產(chǎn)物，充分洗滌并過(guò)濾，再用無(wú)水乙醇充分洗滌、過(guò)濾，真空干燥，得到白色產(chǎn)物，產(chǎn)率為67%。

1.4 TUCS-Zn配合物表征

采用KBr壓片，測(cè)定 CS、TUCS及 TUCS-Zn的紅外光譜;用1%(v/v)乙酸溶解配制1 mg/mL的CS、TUCS和TUCS-Zn溶液，于200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定紫外吸收光譜;以α-Al2O3為參比，升溫速率10 ℃ /min，對(duì) CS、TUCS、TUCS-Zn 進(jìn)行熱力學(xué)分析;采用XRD-6000粉末衍射儀，Kα射線，Zn靶，掃描范圍:0-40(2θ)，電壓40 kV，電流30 mA。

1.5 TUCS-Zn配合物抑菌活性及最低抑菌濃度的測(cè)定

抑菌圈法是將含有定量抗生素的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加抗生素的濃度呈對(duì)數(shù)減少，在藥物濃度到達(dá)的范圍內(nèi)對(duì)此藥敏感的細(xì)菌不能生長(zhǎng)而形成透明的抑菌圈，以抑菌圈的直徑作為評(píng)定指標(biāo)，抑菌圈直徑越大，說(shuō)明該抑菌劑對(duì)此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。將E.coli和St.aureus接種于牛肉膏固體培養(yǎng)基，37℃活化24 h，制成菌懸液備用。取直徑6 mm已滅菌的圓濾紙片浸泡在濃度均分別為10、5、2.5 mg/mL的TUCS-Zn、TUCS和CS溶液中(1.0%乙酸溶解)。取0.1 mL菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上，爾后用無(wú)菌鑷子夾取浸泡過(guò)的圓濾紙片貼于培養(yǎng)皿中，每皿貼5片。以1.0%的HAc溶液作為空白對(duì)照。37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

將真菌 A.niger接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，在27℃下活化72 h，用已滅菌的打孔器打直徑為0.8 cm 的菌片備用。CS、TUCS、TUCS-Zn與一定量PDA混合，使CS、TUCS及TUCS-Zn的最終濃度為 0.5、1.0、1.5 mg/mL，以等體積的 1.0%HAc溶液作為空白對(duì)照，三氯生為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌后倒平板，待冷卻后在培養(yǎng)皿中央貼一菌片，置于恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)，觀察A.niger菌絲體生長(zhǎng)情況，直到對(duì)照組黑曲霉菌落幾乎長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止。

本實(shí)驗(yàn)采用菌落平板記數(shù)法測(cè)定CS、TUCS、TUCS-Zn的最低抑菌濃度(MIC)。固體培養(yǎng)基和一定濃度的藥物混合，使藥物最終濃度分別為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.5 mg/mL，滅菌倒平板，取0.1 mL稀釋至OD610=0.001的菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上，E.coli和St.aureus在37℃下恒溫培養(yǎng)，A.niger在27℃下恒溫培養(yǎng)，以肉眼觀察不到菌落對(duì)應(yīng)的濃度即為CS、TUCS、TUCS-Zn對(duì) E.coli、St.aureus和 A.niger的 MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 TUCS-Zn配合物表征

2.1.1 紅外光譜

CS、TUCS和TUCS-Zn的紅外光譜如圖1所示。CS中位于3446 cm-1左右的N-H，O-H締合峰形，改性后發(fā)生位移且峰形變窄;CS原位于1664 cm-1處較強(qiáng)的酰胺吸收峰和1599 cm-1左右的-NH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，在TUCS中分別位移至1638 cm-1和1616 cm-1處，峰形變窄;且TUCS在1493 cm-1處出現(xiàn)一弱的新峰，表明在CS結(jié)構(gòu)中的-NH2引入硫脲基團(tuán)［5］。與TUCS相比，TUCS-Zn的紅外光譜在848、916、950、990 cm-1出現(xiàn)新的吸收峰，歸屬為 S-Zn 伸縮振動(dòng)峰。

圖1 CS、TUCS和TUCS-Zn的紅外光譜Fig.1 IR spectra of chitosan，thiourea chitosan and thiourea chitosan-Zn

2.1.2 紫外光譜

CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn的紫外光譜如圖2 所示。CS、TUCS、TUCS-Zn 分別在 224.50、235.00、234.00 nm有強(qiáng)吸收峰，這是由于配合物中氮、氧的孤對(duì)電子發(fā)生n→σ*躍遷和π→π*躍遷，導(dǎo)致電子光譜發(fā)生的變化所致，且在同一濃度下，TUCS-Zn的吸收強(qiáng)度高于CS和TUCS。表明配位作用發(fā)生。

2.1.3 差熱-熱重分析

CS、TUCS和 TUCS-Zn的 TG-DTA曲線如圖3所示。CS的降解分為兩個(gè)階段:第一個(gè)階段在80℃開(kāi)始，失重10%，主要是失去水分子;第二個(gè)階段失重在250℃開(kāi)始，到500℃失重達(dá)最大，失重55%，在230℃有一強(qiáng)的放熱峰，TG曲線上表現(xiàn)為一個(gè)顯著的失重變化;最終分解溫度688℃。TUCS熱分析表明，隨著失重的進(jìn)行，差熱曲線出現(xiàn)多個(gè)放熱峰，是TUCS分解、氧化、燃燒的結(jié)果。在98.2℃～150℃之間有明顯失重并伴有2個(gè)低矮的放熱峰，失重達(dá)4.7%，當(dāng)溫度升至245℃左右有一強(qiáng)的放熱峰，峰形尖而高，與之相應(yīng)的熱重線又有明顯的失重拐點(diǎn)。這是由于TUCS減弱了殼聚糖分子的規(guī)整度和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而降低了殼聚糖的結(jié)晶程度，導(dǎo)致分解溫度降低;對(duì)于TUCS-Zn，當(dāng)溫度升至217℃左右有一強(qiáng)的放熱峰，峰形尖而高，與之相應(yīng)的熱重線又有明顯的失重拐點(diǎn)。可能是由于TUCS與Zn2+配位后，其分子內(nèi)的氫鍵結(jié)合被破壞，結(jié)晶度發(fā)生改變，熱穩(wěn)定性減小。這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化表明，TUCS與金屬離子配合后，分子中不同金屬離子與含有孤對(duì)電子的活性基團(tuán)-NH2、-OH的配合作用，不僅改變了聚合物的部分化學(xué)鍵性質(zhì)及其原子之間的相互作用，必然要改變它們的穩(wěn)定的空間構(gòu)象［6］，進(jìn)而此次級(jí)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變溫度略有降低，它們的不穩(wěn)定性是由于缺少自由的氨基，在制備衍生物時(shí)氨基被取代，而CS因其有自由的氨基而更穩(wěn)定。

圖2 CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn 的紫外光譜(1-硫脲，2-CS，3-TUCS，4-TUCS-Zn)Fig.2 UV spectrum of chitosan，thiourea，thiourea chitosan，thiourea chitosan Zn(II)

圖3 CS、TUCS和TUCS-Zn的TG-DTA 曲線Fig.1 TG-DTA curves of chitosans(A)，thiourea chitosan(B)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(C)

2.1.4 X-射線衍射

圖4 為CS、TUCS和TUCS-Zn的X衍射譜圖。CS 在2θ 為10.4°和19.8°處出現(xiàn) 2 個(gè)特征衍射峰，呈現(xiàn)“L-2 polymorph”晶型衍射圖。TUCS在這兩處的衍射峰強(qiáng)度顯著減弱，是由于TUCS減弱了CS分子的規(guī)整度和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而降低了CS的結(jié)晶程度。TUCS-Zn在10.4°和 19.8°處的衍射峰幾乎消失，出現(xiàn)新的衍射峰，表明有規(guī)則的結(jié)晶相形成［7］。采用elementar Vario EL元素分析儀測(cè)得C%(38.1)，H%(6.42)，N%(8.42)，S%(0.4)，WF-110B原子吸收光譜儀測(cè)得Zn(Ⅱ)%(9.85)。

圖4 CS(a)、TUCS(b)和TUCS-Zn(c)的X衍射譜圖Fig.4 XRD of chitosans(a)，thiourea chitosan(b)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(c).

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

抑菌圈直徑越大，說(shuō)明該抑菌劑對(duì)此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。不同濃度CS、TUCS 和 TUCS-Zn對(duì) E.coli和 St.aureus對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑如表1所示。可以看出，CS、TUCS和TUCS-Zn作用 E.coli和 St.aureus后，均具有明顯的抑菌圈，且隨著樣品濃度的增加，與對(duì)照組相比抑菌圈的直徑逐漸增加;TUCS-Zn的抑菌圈直徑比單一的CS、TUCS顯著增大，說(shuō)明 TUCS-Zn對(duì) E.coli和St.aureus的生長(zhǎng)有較好的抑制作用。TUCS和金屬鋅離子配位后，雖然一定程度上破壞了結(jié)構(gòu)中的-NH2的陽(yáng)離子化，使消毒因子-NH3+減少，但分子表面正電荷密度增加，從而增強(qiáng)了聚陽(yáng)離子吸附到帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面的能力，并且Zn2+具有較多的核外電子和較小的離子半徑，與TUCS結(jié)合作用很強(qiáng)，具有高電子密度的TUCS-Zn配合物更容易和細(xì)菌表面作用進(jìn)而顯示更強(qiáng)的抑菌效果。且Zn2+也具很強(qiáng)的抑菌性能，故TUCS-Zn配合物的抑菌性能較CS、TUCS遠(yuǎn)遠(yuǎn)增強(qiáng)。

表1 CS、TUCS和TUCS-Zn對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈Table 1 Bacteriostasis-diameter of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli and St.aureus

TUCS-Zn配合物對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響如表2所示。當(dāng)黑曲霉培養(yǎng)第4 d時(shí)，對(duì)照組黑曲霉菌落的徑向生長(zhǎng)十分旺盛，菌落覆蓋了整個(gè)培養(yǎng)皿，有大量呈炭黑色的孢子生長(zhǎng)繁殖。在培養(yǎng)基中加入殼聚糖、TUCS和TUCS-Zn后，黑曲霉菌落的徑向生長(zhǎng)均比對(duì)照組小，其中培養(yǎng)基中加入TUCS-Zn后黑曲霉菌落的徑向生長(zhǎng)最小，且隨著TUCS-Zn濃度的增大，菌絲體直徑逐漸減小。數(shù)據(jù)表明CS、TUCS和TUCS-Zn對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)均有抑制作用，且TUCS-Zn的抑制作用最強(qiáng)。

表2 CS、TUCS和TUCS-Zn(II)對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)on the growth of A.niger

由表3可以看出，改性后的TUCS和TUCS-Zn對(duì)三種被試菌的最小抑菌濃度都比殼聚糖小，進(jìn)一步說(shuō)明TUCS-Zn配合物具有更好的抑菌性能。

表3 CS、TUCS 和 TUCS-Zn(II) 對(duì) E.coli、St.aureus和 A.niger的最小抑菌濃度Table 3 MIC of CS、TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli，St.aureus and A.niger

3 結(jié)論

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，對(duì)合成的TUCS及TUCS-Zn(II)配合物進(jìn)行了表征。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TUCS-Zn配合物對(duì)細(xì)菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能比單一的CS、TUCS顯著提高，對(duì)真菌黑曲霉亦具有較強(qiáng)的抑制作用。

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Preparation，Characterization and Antimicrobial Activity of Thiourea-chitosan-Zn(II)Complex

FENG Xiao-qiang*，LI Xiao-fang，YANG Sheng，ZHANG Jing-feng
College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001

O627181

A

1001-6880(2012)08-1075-05

2010-07-28 接受日期:2012-06-02

甘肅天水師范學(xué)院物理無(wú)機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金資助項(xiàng)目(ZD0840)

*通訊作者 Tel:86-015337018100;E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com