基于hsp65基因的PCR技術(shù)在檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌的應(yīng)用

譚 笑

（湖南省結(jié)核病防治所檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410006）

盡管在上世紀(jì)結(jié)核得到了有效控制，但WHO數(shù)據(jù)表明，結(jié)核依然是發(fā)展中國家目前面臨的重要難題[1]。據(jù)估計(jì)，全球約有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)感染數(shù)可達(dá)890～990萬[2,3]。建國以來，我國結(jié)核的感染數(shù)雖然明顯降低，但近年來隨著結(jié)核菌基因多態(tài)性和變異、耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生、HIV/AID的流行、人口和人員流動(dòng)快速增加、BCG效果不佳、診斷技術(shù)低劣、防治措施削弱等因素，結(jié)核病疫情出現(xiàn)回升或失控趨勢(shì)[4,5]。1997年WHO再次提出“遏制結(jié)核病的行動(dòng)刻不容緩”。因此，尋求一種簡(jiǎn)單快速的診斷方法是全世界醫(yī)療工作者的不懈追求。

結(jié)核的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括齊-尼抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)。抗酸染色雖然簡(jiǎn)單，但敏感性差。而分離培養(yǎng)不但耗時(shí)，活菌獲取也是另一大難題[6]。其余分子生物學(xué)方法如DNA探針技術(shù)，但因需要特殊設(shè)備，難以在一般實(shí)驗(yàn)室開展[7]。本研究旨在評(píng)價(jià)基于hsp65基因的PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 標(biāo)本處理

2011年10月湖南省結(jié)核病醫(yī)院總共收集臨床標(biāo)本80份 （68份痰液標(biāo)本，10份腦脊髓液標(biāo)本和2份活組織標(biāo)本），所有標(biāo)本經(jīng)Ziehl-neelsen染色，并按Petroff氏法處理后接種于L-J斜面培基中。種屬鑒定包括對(duì)LJ培養(yǎng)基上生長的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以及尼克酸實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)加以證實(shí)。

對(duì)于PCR標(biāo)本前的處理，首先將液化后的痰液標(biāo)本加入2mL 4%NaOH中和，37℃孵育20min。隨后加入18mL中和緩沖液 （每1000mL溶液中含3.40g KH2PO4和 3.55g Na2HPO4/L,pH6.8），3500g離心20min，棄上清。用1mL中和緩沖液重懸浮后置于-20℃保存。

1.2 DNA提取

解凍后的標(biāo)本于6000rpm離心1min，棄上清。沉淀物用 200mL TE緩沖液 （10 mM Tris-HCl[pH8.0],1mM EDTA）重懸浮,攪拌混勻。隨后將混合物置于100℃水浴15min以滅活細(xì)菌并釋放其DNA。16000r/m離心5min，獲取上清液并分裝到無菌Ep中，-20℃保存待檢。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)結(jié)核分枝桿菌hsp65基因序列設(shè)計(jì)引物。其中上游引物：5'-ACCAACGATGGTGTG TCCAT-3'，下游引物：5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3'，最終產(chǎn)物長度為441bp。100mL反應(yīng)體系中含有1×PCR 緩沖液、25mm MgCl2， 2.5mM dNTP、0.5mM 引物和0.5u Taq DNA聚合酶（Roche）和適量的標(biāo)本DNA，最終用ddH2O使終體積為100μL。每組PCR反應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照（H37Rv株）和陰性對(duì)照（等等體積ddH2O）。反應(yīng)體系于94℃預(yù)變性4min，隨后按照以下反應(yīng)條件進(jìn)入 35個(gè)循環(huán)：94℃，1min，64℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后一循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物于72℃孵育10min。

1.4 PCR產(chǎn)物觀察

擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴乙啶的1X Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液中 （pH8.6）中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%）。當(dāng)凝膠在紫外條件下在441bp位置出現(xiàn)肉眼可見條帶判斷為陽性。

1.5 測(cè)序

PCR產(chǎn)物直接送至公司測(cè)序。測(cè)序儀為ABI ABPRISM 310基因分析儀，操作步驟按照ABI Big Dye Terminator試劑盒的步驟進(jìn)行。測(cè)序結(jié)束后用序列分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將hsp65基因序列進(jìn)行BLAST。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分支桿菌檢出情況

本文所研究的80份臨床標(biāo)本經(jīng)Ziehl-Neelsen染色、分離培養(yǎng)顯示其中59份標(biāo)本有MTB感染（73.75%）。而用直接PCR法，53份標(biāo)本（21份痰標(biāo)本和2份腦脊液標(biāo)本）呈陽性（66.25%），見表1所示。

表1 不同方法對(duì)不同來源標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢出情況（例，n）

2.2 PCR法與培養(yǎng)法一致性情況

53份PCR陽性標(biāo)本顯示51例分離培養(yǎng)陽性。8份標(biāo)本在培養(yǎng)基中顯示為陽性而在PCR檢測(cè)中顯示為陰性。另外有2份標(biāo)本在PCR檢測(cè)中顯示為陽性而在培養(yǎng)基中顯示為陰性。PCR的敏感性為86.44%（51/59）和特異性為 90.48%（19/21），其陽性預(yù)測(cè)值為96.23% (51/53)，陰性預(yù)測(cè)值為70.37%(19/27)。見表2所示。

表2 PCR與分離培養(yǎng)一致性情況

2.2 hsp基因DNA自動(dòng)測(cè)序分析

隨機(jī)挑選12份PCR反應(yīng)陽性株產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并通過BLAST對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，4株與GenBank里登錄號(hào)為FJ921154的序列一致，4例與JF921160一致，其他分別與JF21153、JF921156、JF21159和JF21161一致。這12株臨床株與結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的相似性達(dá)99%以上。

3 討論

在結(jié)核病的防控當(dāng)中，MTB的早期快速診斷顯得非常重要。當(dāng)前，Ziehl-Neelsen染色法和MTB培養(yǎng)是篩查MTB感染所常規(guī)采用的技術(shù)。然而Ziehl-Neelsen染色法敏感性較低，而細(xì)菌培養(yǎng)法又非常費(fèi)時(shí)[8]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法為結(jié)核的快速診斷提供了可能，特別是對(duì)于已接受抗生素治療的患者，PCR依然能有效檢測(cè)出MTB的DNA。特別是當(dāng)常規(guī)技術(shù)的局限性對(duì)病人的健康造成嚴(yán)重影響的時(shí)候如，當(dāng)疾病復(fù)發(fā)或者治療失敗，以及對(duì)于HIV血清陽性的病人，PCR技術(shù)具有不可替代的作用[9]。

由于臨床標(biāo)本（如痰液）中往往含有多種干擾PCR反應(yīng)的因素，這給DNA擴(kuò)增帶來了一定的難度[10]。在本研究檢測(cè)的70份標(biāo)本中，PCR對(duì)51份標(biāo)本顯示了很好的敏感度和特異性。其敏感度和特異性分別達(dá)86.44%和90.48%，與國外相關(guān)報(bào)道一致[11]。目前國內(nèi)外采用PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本的靈敏度一般在55%～90%之間，其較大差異發(fā)生的原因可能是不同的研究采用了不同的商品化試劑盒，且均以培養(yǎng)陽性標(biāo)本作為金標(biāo)準(zhǔn)所致[12,13]。此外，在本研究當(dāng)中，PCR陽性的2份臨床標(biāo)本培養(yǎng)失敗，這可能是在檢測(cè)前患者使用過抗生素或標(biāo)本DNA提取因素所致[14]。限制PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要因素是假陰性，本研究當(dāng)中有8例培養(yǎng)陽性患者PCR擴(kuò)增陰性，這可能與標(biāo)本本身含菌量少導(dǎo)致DNA提取效率低下或者存在PCR抑制物有關(guān)。

所有的分枝桿菌屬均有hsp65的靶基因，它比16S rRNA基因更容易得到，在分枝桿菌屬高度保守[15]。序列分析顯示從臨床標(biāo)本中提取的DNA與MTB復(fù)合群有關(guān)。此外，hsp65基因序列是鑒別分支桿菌不同種屬之間的有效工具，因此，hsp65基因可以用來區(qū)別MTB復(fù)合群與其它非結(jié)核的分枝桿菌屬。這次研究的結(jié)果表明所有的序列產(chǎn)物序列均為MTB的共有序列，并與牛分枝桿菌具有極高的相似性。這兩種菌株均屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，在生物進(jìn)化過程中來自于同樣的祖先。

總之，本研究證明基于hsp65基因的PCR產(chǎn)物是實(shí)驗(yàn)室診斷MTB復(fù)合群的最可靠的技術(shù)。它能有效鑒別MTB與非結(jié)核分枝桿菌。但是要鑒別MTB復(fù)合群，特別是MTB與牛分枝桿菌的區(qū)別，還有待通過對(duì)hsp65和pncA基因測(cè)序加以確定。

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