HPV E6/E7mRNA和HC2-HPV-DNA檢測(cè)對(duì)宮頸病變篩查的意義

賈政軍，周玉春，胡 蓉，彭向京，黃定梅，王 華，王 丹，何 思

(湖南省婦幼保健院遺傳室，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

在世界范圍內(nèi)，子宮頸癌的發(fā)病率、死亡率位居?jì)D女惡性腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著人類的健康。早在1842年，Rogoni-stern[1]就推測(cè)宮頸癌的發(fā)生與性傳播疾病有關(guān)。1974年，Zur hausen[2]首次提出人乳頭瘤病毒（HPV）感染與宮頸癌有密切關(guān)系，甚至是因果關(guān)系。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)100多種型別的HPV，其中40多種已證實(shí)與人類生殖道感染有關(guān)[3]，其中與宮頸癌相關(guān)的最常見(jiàn)型別為HPV16型和HPV18型。

HPV是一類僅感染人皮膚、粘膜上皮細(xì)胞的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，長(zhǎng)約7.8-8Kb。能引起皮膚粘膜的多種增生性病灶，HPV感染后持續(xù)性刺激角化細(xì)胞，并提供有絲分裂增殖的腫瘤基因，持續(xù)表達(dá)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。由于基因型不同，引起粘膜上皮細(xì)胞病理變化的類型也不同，其中HPV16、18、33、58等型與宮頸癌和上皮內(nèi)瘤樣變關(guān)系比較密切 （稱高危型），HPV6、11型等病毒主要引起生殖器疣（稱低危型）。高危型HPV的E6和E7蛋白通過(guò)與抑癌基因P53及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)相互作用，參與宮頸癌的發(fā)生。目前，二代基因雜交捕獲法 (hybrid capture II，HC2)檢測(cè)高危型HPVDNA對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷具有重要的參考價(jià)值。本文旨在評(píng)價(jià)TCT和HC2-HPV-DNA檢測(cè)在婦女宮頸癌前病變篩查工作中的應(yīng)用價(jià)值，從而為這一群體的臨床治療及隨訪工作提供更有價(jià)值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008年1月至2011年11月湖南省婦幼保健院門診病例、懷疑宮頸病變的187例女性為研究對(duì)象，年齡21～62歲，中位年齡37.8歲。所有研究對(duì)象均進(jìn)行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和用宮頸拭子獲取脫落細(xì)胞進(jìn)行HC2-HPV-DNA檢測(cè)及病理活檢。

1.2 方法

1.2.1 宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷

10%福爾馬林固定標(biāo)本，按1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小取材，分別用80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水2 h，用二甲苯溶解石蠟，使組織塊充分浸入石蠟包埋，切片，厚度約為4～6 mm，常規(guī)HE染色，常規(guī)封片，根據(jù)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)閱片。將組織標(biāo)本區(qū)分為慢性宮頸炎、癌前病變 CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌。

1.2.2 TCT及診斷標(biāo)準(zhǔn)

將液基細(xì)胞塑料取材刷插入宮頸，順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)5～8圈，將官頸外口及宮頸管的脫落細(xì)胞裝入液基細(xì)胞保存液中，按儀器操作說(shuō)明自動(dòng)制片，95%酒精固定，巴氏染色。診斷標(biāo)準(zhǔn)采用TBS(The Bethesda System)分級(jí)系統(tǒng)，即：無(wú)上皮內(nèi)病變或惡性病變 (negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM)，意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamouseeHs of undetermined significance,ASCUS)，鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion,SIL)和鱗狀細(xì)胞癌 (squamous cell carcinoma,SCC)。SIL包括鱗狀上皮內(nèi)低度病變 (low-grade squamous intraepithelial lesion,ISIL)和鱗狀上皮內(nèi)高度病變 (high-grade squmnous intraepithelial lesion,HSIL)。腺上皮不正常為意義不明的不典型腺細(xì)胞(atypical glandular cell of undetermined significance,AGUS)和腺癌。以炎癥、ASCUS和LSIL為陰性，以AGUS、腺癌和HSIL為陽(yáng)性。

1.2.3 HC2-HPV-DNA檢測(cè)及診斷標(biāo)準(zhǔn)

標(biāo)本采集均使用一次性取樣器插入官頸管順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)5～8圈，取頸管分泌物裝入特制保存液中，采用美國(guó)Digene公司提供的試劑盒，通過(guò)基因捕獲技術(shù)(HC2)檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒(HPVDNA)16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、68，檢測(cè)結(jié)果的診斷標(biāo)準(zhǔn)是RLU(相對(duì)光單位，光信號(hào))/Cutoff(域值=三個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控指標(biāo)的平均值)≥1為陽(yáng)性，

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)價(jià)方法

病理報(bào)告為CINl級(jí)/濕疣及以上病變者判為陽(yáng)性，報(bào)告慢性炎者為陰性；TCT報(bào)告為L(zhǎng)SIL及以上者定義為篩查陽(yáng)性；HC2-HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果≥1即為篩查陽(yáng)性；兩者聯(lián)合檢測(cè)，TCT和HC2-HPV-DNA均陽(yáng)性時(shí)定義為陽(yáng)性，兩者之中有一項(xiàng)陰性者或兩項(xiàng)均陰性者定義為陰性。以病理學(xué)診斷結(jié)果做為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算TCT檢測(cè)、HG2-HPV-DNA檢測(cè)以及兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的敏感度、特異度、假陰性率、假陽(yáng)性率、診斷符合率，做為評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷結(jié)果

在檢測(cè)的187例宮頸組織中，陰性病變（宮頸炎）126例（67.38%），陽(yáng)性病變（CINⅠ31 例，CINⅡ～Ⅲ 16例，宮頸癌14例）共61例（32.62%）。病理切片如圖 1-1，1-2，1-3 所示。

圖1 宮頸組織宮頸組織理診斷結(jié)果(HE染色×400)

2.2 檢測(cè)結(jié)果

187例患者TCT、HC2-HPV-DNA與病理活檢結(jié)果見(jiàn)表1。以病理學(xué)診斷結(jié)果做為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算TCT檢測(cè)、HG2-HPV-DNA檢測(cè)以及兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的敏感度、特異度、假陰性率、假陽(yáng)性率、診斷符合率，發(fā)現(xiàn)HC2-HPV-DNA對(duì)絕經(jīng)后婦女宮頸病變的篩查敏感性高于TCT檢測(cè)，但其特異度明顯低于后者，并且HC2-HPV-DNA檢測(cè)的假陰性率要優(yōu)于TCT檢測(cè)；兩者聯(lián)合檢測(cè)可明顯降低假陽(yáng)性率、提高診斷的特異度及診斷符合率(表2)。

表1 TCT、HC2-HPV-DNA與病理活檢結(jié)果（例）

表2 TCT、HC2-HPV-DNA及兩者聯(lián)合檢測(cè)的評(píng)價(jià)指標(biāo)

3 討論

自從1974年Zur Hausen提出人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌發(fā)病有關(guān)的假設(shè)后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就HPV感染與宮頸癌的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究[5]，報(bào)道稱95%的宮頸癌患者合并有HPV感染[6]，1995年國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì) （IARC）專題討論會(huì)認(rèn)為，HPV感染是宮頸癌的主要病因。

HPV感染生殖道，可潛伏若干年，一旦機(jī)體免疫力降低，潛伏的病毒可恢復(fù)活動(dòng)。HPV感染過(guò)程通常分為潛伏感染期、亞臨床感染期、臨床癥狀期和HPV相關(guān)的腫瘤期。宮頸癌也有一系列的前驅(qū)病變，即宮頸上皮不典型增生，在病理上稱宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN），通常又根據(jù)嚴(yán)重程度分成三級(jí)：宮頸上皮內(nèi)輕度瘤變（CIN I）、宮頸上皮內(nèi)中度瘤變（CIN II）和宮頸上皮內(nèi)高度瘤變（CIN III），這些癌前病變均有可能發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌。

在某些自然的或?qū)嶒?yàn)條件下，HPV病毒誘發(fā)的乳頭狀瘤雖具有轉(zhuǎn)化為鱗狀上皮細(xì)胞癌的傾向，然而并不是所有的HPV感染者和CIN都會(huì)發(fā)展為癌。對(duì)于大多數(shù)乳頭狀瘤，這種轉(zhuǎn)化還需要其它輔助因子的存在，例如吸煙、化學(xué)物質(zhì)、宿主（例如HIV感染）和環(huán)境因素等協(xié)同作用，對(duì)疣、乳頭狀瘤轉(zhuǎn)為惡性腫瘤有致突變及啟動(dòng)作用。Nasiell[7]等人隨訪了555例病理診斷為CIN I的病人，平均隨訪時(shí)間為43月，發(fā)現(xiàn)62%的病人病情轉(zhuǎn)歸為正常，22%的病人病情維持原狀，16%的病人病情進(jìn)一步發(fā)展；對(duì)894例病理診斷為CIN II的病人隨訪65個(gè)月，結(jié)果54%的病人病情轉(zhuǎn)歸為正常，16%的病人病情維持原狀，30%的病人病情進(jìn)一步發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HC2-HPV-DNA對(duì)婦女官頸病變的篩查敏感性優(yōu)于TCT檢測(cè)，但其特異度明顯低于后者。另外，HC2-HPV-DNA假陽(yáng)性率較高，TCT檢測(cè)假陽(yáng)性率較HC2-HPV-DNA檢測(cè)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩種方法檢測(cè)結(jié)果可優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，聯(lián)合應(yīng)用，不僅可顯著降低假陽(yáng)性率，并且明顯提高診斷的特異度及診斷符合率。

我們認(rèn)為，要提高診斷符合率，最好做到以下幾點(diǎn)。首先，要做好宮頸脫落細(xì)胞的取材、制片及細(xì)胞診斷的規(guī)范化培訓(xùn)工作，在宮頸癌篩查工作中，專業(yè)隊(duì)伍或技術(shù)骨干的培訓(xùn)十分重要，對(duì)于任何篩選方案的落實(shí)都是決定性因素，篩查人員是否專業(yè)以及經(jīng)驗(yàn)的多少、診斷水平的高低，對(duì)診斷標(biāo)準(zhǔn)的把握等均影響篩查效果。其次，注重多種篩查方法的聯(lián)合應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TCT及HC2-HPVDNA這兩種篩查方法，均存在較高的誤診率及漏診率，兩種篩查方法聯(lián)合應(yīng)用，則明顯提高診斷符合率[8]。因此，在做好宮頸癌篩查規(guī)范化培訓(xùn)工作的同時(shí)，盡可能聯(lián)合應(yīng)用TCT及HC2-HPV-DNA這兩種篩查方法，提高診斷符合率，最大程度降低假陽(yáng)性及假陰性率，切實(shí)提高診斷的準(zhǔn)確性，以免遺漏嚴(yán)重病變及減少不必要的陰道鏡檢查及病理活檢的痛苦。

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