云南省精神分裂癥患者關(guān)聯(lián)基因檢測*

任玉霞，周小龍，張海燕，高恒亮，陳繼峰#

1)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州 450001

2)甘肅亞盛集團博士后科研工作站北京分站 北京 100101

精神分裂癥是以基本個性、思維、情感和行為的分裂，精神活動與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征的一類最常見的精神疾病，是多基因遺傳病[1-2]。近年來有一些報道[3-5]表明，谷氨酸能功能失調(diào)與精神分裂癥相關(guān)，如親離子型谷氨酸受體NR1、NR2A、KA1、GluR7及一些代謝型谷氨酸能受體亞單位mGluR3、GRID1等都與神經(jīng)突觸可塑性相關(guān)。此外，調(diào)節(jié)性G蛋白信號4、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1、右旋氨基酸氧化酶(DAO)與DAO激活劑(DAOA)也與精神分裂癥相關(guān)。根據(jù)目前與谷氨酸能受體系統(tǒng)相關(guān)基因在精神分裂癥遺傳學(xué)方面的研究及谷氨酸能功能不平衡假說的研究[6]，作者選擇了谷氨酸遞質(zhì)系統(tǒng)中的4個基因的4個 SNPs位點即:mGluR3基因 GRM3(位點rs2299225)、NR1 基因 GRIN1(位點 rs11146020)、GRID1基因(位點rs2814351)和DAOA基因G72/G30(位點rs778293)進行了研究，觀察以上位點與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣本來源 HotMaster酶、dNTPs均由北京天根公司提供，所有引物均由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，核酸外切酶Ⅰ與蝦堿性磷酸酶(SAP)購自 Fermentas公司，biotin-14-dCTP與 TSP酶購自Invitrogen公司，dATP、dGTP、dTTP購自寶生物工程有限公司，堿性磷酸酶鏈霉親和素購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，去離子甲酰胺為Sigma公司生產(chǎn)，BCIP/NBT購自Amresco公司。病例組及對照組血樣來自云南省紅河精神病院。兩組樣本DNA的提取由云南大學(xué)完成。病例組樣品共255個，其中女性80個，男性175個，患者年齡27～55(41.4±10.0)歲。對照組樣品共262個，其中女性101個，男性161個，對照年齡26～57(40.3±10.0)歲。所有患者均符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM2Ⅳ)精神分裂癥的診斷標準，排除合并嚴重器質(zhì)性疾病及精神活性物質(zhì)濫用者。對照者均排除精神疾病，且家族中無精神疾病及自殺者，個體間無血緣關(guān)系。

1.2 引物設(shè)計 針對每個SNP設(shè)計一對PCR引物(PF/PR)、一對等位基因特異性引物延伸(allelespecific primer extension，ASPE)引物(其 5’端 24 個堿基為標簽tag序列)和一對反義標簽(anti-tag)。tag與anti-tag選自美國Luminex公司的一套設(shè)計，為互補序列，長度均為24個堿基。全部引物和標簽的名稱及序列見表1。

表1 引物和標簽序列

1.3 SNP位點的擴增

1.3.1 PCR 以總基因組為模板，PCR擴增包含SNP位點的 DNA片段。PCR反應(yīng)體系50 μL，含1 × PCR Buffer，dNTPs 0.2 mmol，引物 PR、PF 各 0.2 μmol，HotMaster酶2.5 U，DNA 40 ng。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min;94℃變性40 s，54℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 ASPE反應(yīng) 在ASPE反應(yīng)之前，先用核酸外切酶Ⅰ9 U和SAP 4.5 U對上述PCR產(chǎn)物進行處理;反應(yīng)條件為37℃ 20 min，80℃ 20 min;反應(yīng)體系為 100 μL，含 dATP、dGTP、dTTP 各 5 μmol，模板為上步 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 45 μL，biotin-14-dCTP 3.2 μmol，TSP 酶 2.5 U，10 × PCR Buffer 5.5 μL，Mg2+0.75 mmol。ASPE反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán);4℃保存。產(chǎn)物純化:在ASPE反應(yīng)產(chǎn)物中加200 μL 預(yù)冷無水乙醇，3 mol/L NaAC 10 μL 于 －80℃ 30 min離心后棄上清;加500 μL體積分數(shù)70%乙醇，再離心棄上清;用體積分數(shù)70%乙醇清洗，吹干后加40 μL雙蒸水溶解。

1.4 雜交及基因分型 參照Koo等[7]的方法建立了簡易微陣列法。取4個位點的anti-tag溶液0.5 μL(100 μmol/L)，固定在醋酸纖維素膜上，加預(yù)雜交液2.5 mL，37℃預(yù)雜交2 h;換雜交液(去除鮭魚精的預(yù)雜交液)2.5 mL，40 μL ASPE 反應(yīng)產(chǎn)物，37℃雜交 4 h;用洗滌液 1(0.1 × SSC，pH7.0，1 g/L SDS)于37℃洗滌4次，每次10 min;用蒸餾水淋洗1 遍后加入封閉液(20 g/L BSA，0.1 mol/L NaCl，12 g/L Triton-100，0.1 mol/L Tris-HCl pH7.5)3 mL，封閉1 h;加入堿性磷酸酶鏈霉親和素(1.0 g/L)3 μL，37℃孵育 30 min;加入洗滌液 2(0.1 mol/L Tris，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，3.3 g/L Tween 20)于37℃洗滌4次，每次5 min;加入檢測平衡液(0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L MgCl2)，37℃，10 min。以上步驟均在搖床上勻速搖動進行。最后，加入BCIP/NBT顯色液250 μL，于室溫、黑暗且靜止條件下顯色反應(yīng)。根據(jù)雜交信號結(jié)果，對SNP位點進行基因分型。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 基因型數(shù)據(jù)采用SHEsis在線分析軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，單位點及等位基因的遺傳關(guān)聯(lián)分析。采用χ2檢驗比較病例組與對照組各SNP的基因型和等位基因頻率的差異，檢驗水準α=0.05/位點數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 對照組rs2299225、rs11146020、rs2814351 和 rs778293 位點均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡 (χ2=2.802、2.579、0.684 和1.095，P 均 ＞0.05)。

2.2 2組4個位點基因型及等位基因頻率比較見表2～5。

表2 2組rs2299225基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表3 2組rs11146020基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表4 2組rs2814351基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表5 2組rs778293基因型及等位基因頻率比較 例(%)

3 討論

Chen等[8]的研究發(fā)現(xiàn)中國精神分裂癥患者與對照之間rs2299225等位基因頻率存在差異。Albalushi等[9]對日本人群的研究發(fā)現(xiàn)rs2299225位點與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)。該研究顯示rs229925位點與精神分裂癥有關(guān)，是否與樣品類型有關(guān)有待進一步研究。Zhao等[10]在中國漢族群體中發(fā)現(xiàn)rs11146020(1001G/C)的C等位基因在患者組中高頻表達。Martucci等[11]在加拿大多倫多人群研究中未發(fā)現(xiàn)GRIN1基因與精神分裂癥有顯著關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果與Martucci等的研究結(jié)果一致。Guo等[12]在中國北方漢族人群中對GRID1的研究中發(fā)現(xiàn)位點rs2814351與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，而該研究未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)。同一多態(tài)性位點出現(xiàn)了不同的研究結(jié)果，可能與樣本的異質(zhì)性或樣本數(shù)量有關(guān)。

關(guān)于G72/G30的基因研究有許多報道，普遍認為該基因與精神分裂癥顯著相關(guān)[13]，韓燕等[14]的研究結(jié)果是DAOA基因區(qū)域rs778294的一個等位基因(C)與精神分裂癥相關(guān)，而位點rs778293與精神分裂癥無關(guān)。該研究結(jié)果顯示rs778293位點與精神分裂癥有關(guān)，與韓燕等的研究不一致，但也支持G72/G30基因可能與精神分裂癥具有關(guān)聯(lián)性的觀點。G72/G30是人類特異性基因。已有研究[15]顯示G72基因表達在精神分裂癥患者腦前葉有所升高。以上研究表明，進一步研究G72/G30的SNP位點對精神分裂癥的研究具有重要意義。

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