AG490對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖及STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

張 嵩，郝 斌#，李惠翔，張海鵬

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450014

2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

前列腺癌是老年男性常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在歐美地區(qū)的發(fā)病率很高。隨著我國(guó)人民飲食結(jié)構(gòu)、生活條件及人口老齡化的改變，前列腺癌的發(fā)病率逐漸增加[1]。已知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路的異常活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的促進(jìn)作用，而JAK2激酶的異常激活是 STAT3 信號(hào)通路活化的起源[2]。研究[3]顯示，α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)為 JAK2激酶抑制劑，能夠有效阻斷STAT3信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。作者觀察了AG490對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖及STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探究其抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DU145細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。AG490購(gòu)自德國(guó)Biosciences Inc公司，噻唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Western blot所需的蛋白提取試劑盒和抗磷酸化 JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、Cyclin D1及BCL-xL抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖抑制率觀察 DU145細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清+100 U/mL雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)24 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分組，每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組單純用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，AG490各濃度組分別加入終濃度為10、25、50及80 μmol/L 的 AG490，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h 后每孔加入15 μL 5 g/L的MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μL DMSO。上機(jī)檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)，細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.3 STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè) 采用Western blot法。細(xì)胞同上分組處理，培養(yǎng)至72 h，使用核蛋白和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，濾膜經(jīng)脫脂奶粉37℃封閉1 h后，分別加入按1∶1000稀釋的一抗p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1 及BCL-xL后4℃孵育過(guò)夜，TTBS洗膜3次，每次10 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TTBS洗膜3次，暗室內(nèi)ECL顯色，X光片曝光成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用3×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較AG490作用時(shí)間和劑量對(duì)DU145細(xì)胞增殖抑制率的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

AG490處理后DU145細(xì)胞增殖抑制率的比較見表1，STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)見圖1。

表1 不同劑量AG490處理不同時(shí)間DU145細(xì)胞的增殖抑制率(n=6) %

圖1 不同劑量AG490作用72 h后DU145細(xì)胞STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

STAT3在正常組織細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中激活速度快且作用時(shí)間短暫。Rivat等[4]研究發(fā)現(xiàn)許多人類惡性腫瘤中存在STAT3信號(hào)通路過(guò)度激活與表達(dá)。JAK2是STAT3信號(hào)通路中的上游激酶，其活化后能募集胞質(zhì)中的STAT3單體，使STAT3分子酪氨酸磷酸化，從而快速激活STAT3信號(hào)通路產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈脂類衍生物，結(jié)構(gòu)與酪氨酸類似，通過(guò)與受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化。現(xiàn)在AG490已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療，如白血病、肝癌[7-8]等。

該研究結(jié)果顯示，AG490作用于DU145細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯受抑，抑制率最高接近80%。同時(shí)，AG490還能抑制STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。推測(cè)p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)減少致靶基因中的細(xì)胞調(diào)控基因Cyclin D1及凋亡抑制基因BCL-xL的蛋白表達(dá)降低，使細(xì)胞周期停滯及凋亡增加，從而有效阻斷STAT3信號(hào)通路，抑制腫瘤增殖。此外，Ueda等[9]研究發(fā)現(xiàn)AG490除抗腫瘤作用外，還能抑制雄激素受體的激活，抑制率高達(dá)85%，因此更加適合前列腺癌的治療。

綜上所述，AG490能抑制前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與其阻斷STAT3信號(hào)通路有關(guān)。AG490有望成為前列腺癌化療的全新藥物。

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