抗抗總黃曲霉毒素單抗F(ab’)2多克隆抗體的制備及特性

劉智勇，孫錦峰

1)鶴壁市衛(wèi)生監(jiān)督中心 鶴壁 458030

2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFB)是由寄生曲霉和產(chǎn)毒的黃曲霉污染糧油及其制品、飼料所產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素 B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最強(qiáng)，污染最為嚴(yán)重，是自然界存在的最嚴(yán)重的化學(xué)致癌物之一。許多國(guó)家和地區(qū)都規(guī)定了食品及飼料中AFB1的最大允許含量，并作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)和控制。我國(guó)對(duì)AFB1的污染和控制也非常重視。目前常應(yīng)用抗AFB1單克隆抗體(單抗)的免疫分析方法測(cè)定AFB1，但因在檢測(cè)過(guò)程中必須頻繁接觸較高濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致很多檢測(cè)人員具有很強(qiáng)的心理戒備。另外，由于發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的禁運(yùn)，我國(guó)很難得到AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使得食品及飼料中AFB1的檢測(cè)分析受到限制。利用Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)[1-3]可知抗獨(dú)特型抗體(Ab2)在空間構(gòu)象上與抗原存在內(nèi)影像關(guān)系，能替代原始抗原，因此利用抗黃曲霉毒素單抗的F(ab’)2片段可制備出抗抗黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型抗體，后者有望作為AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的替代品用于AFB1的無(wú)毒免疫學(xué)檢測(cè)。作者采用多克隆抗體(多抗)的制備方法生產(chǎn)出抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型抗體，并對(duì)其特性進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 SephacrylTMS-200分子篩凝膠和甘氨酸(美國(guó)Amersham公司)，無(wú)花果蛋白酶、AFB1、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白(KLH)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、戊二醛和正辛酸(美國(guó)Sigma公司)，硫酸銨(北京化學(xué)試劑公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司)，96孔可拆分酶標(biāo)板(美國(guó)Gibco公司)?？箍傸S曲霉毒素單抗、抗赭曲酶毒素(OA)單抗、抗T-2毒素單抗、抗河豚毒素(TTX)單抗均由作者制備。低溫高速離心機(jī)(德國(guó)HermLe公司)、SUNRISE酶標(biāo)分析儀(瑞士Tecan公司)、AKTA快速蛋白液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Amersharm公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性日本大耳白兔3只，健康雌性日本大耳白兔1只，體質(zhì)量1.0～1.5 kg，購(gòu)自北京富豪動(dòng)物養(yǎng)殖中心[SCXK(京)2000-0019];6～8周齡雌性未經(jīng)產(chǎn)BALB/C小鼠3只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.3 抗總黃曲霉毒素單抗2G2株F(ab’)2片段的制備 用無(wú)花果蛋白酶酶切辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化[4]所得的抗總黃曲霉毒素單抗2G2株腹水(均由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室制備)，采用分子篩凝膠過(guò)濾法經(jīng)快速蛋白純化儀(FPLC)分離純化酶切片段，得到單抗F(ab’)2片段，經(jīng)特性鑒定后－20℃凍干保存。

1.4 大分子免疫原F(ab’)2-KLH的制備 采用戊二醛一步法。將1 mL F(ab’)2片段與含20 mg純KLH的凍干粉末溶解于適量硼酸緩沖液(pH 10.0)中，然后緩慢加入新鮮配制的1 mL體積分?jǐn)?shù)0.3%戊二醛溶液，室溫避光放置2 h，期間輕輕攪拌，加入1 mol/L甘氨酸終止未反應(yīng)的戊二醛，靜置30 min。加20倍體積的硼酸緩沖液(pH 8.5)透析過(guò)夜，每4 h換液1次。

1.5 免疫血清的制備和純化 取F(ab’)2-KLH及F(ab’)2片段(均為1 g/L)，各加等體積的CFA充分乳化后，分別于家兔背部皮下多點(diǎn)注射免疫。首次免疫后間隔3周，再以1 mL免疫原(0.5 g/L)加等體積IFA乳化后，注入皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫。而后，每隔2周按第二次免疫法重復(fù)加強(qiáng)免疫。每次免疫前抽少許靜脈血，分離血清，采用抗體包被酶標(biāo)板檢測(cè)抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到平臺(tái)期后，以250 μg免疫原耳緣靜脈免疫，3 d后頸動(dòng)脈放血處死。血液于4℃環(huán)境下放置，約1 h，使血塊凝固收縮，收集析出的血清，剩余血塊全部?jī)A入離心管，在常溫下2500 r/min離心30 min，取上清液與前面的血清混合，分裝成1 mL/管，－20℃保存。

1.6 單抗-HRP復(fù)合物的制備 采用過(guò)碘酸鈉法。分別將HRP與抗總黃曲霉毒素單抗、抗赭曲酶毒素單抗、抗T-2毒素單抗和抗河豚毒素單抗連接。在1.2 mL純水中溶解5 mg HRP，加入新配制的0.1 mol/L 過(guò)碘酸鈉(pH 7.0)0.3 mL，置室溫 20 min。在1 mmol/L醋酸鈉(pH 4.0)中4℃透析24 h，期間更換透析液數(shù)次。用0.02 mol/L碳酸鈉溶液(pH 9.5)制備抗體樣品至10 g/L。將0.5 mL抗體加至經(jīng)透析的HRP溶液中，置室溫2 h。加入100 μL硼氫化物(4 g/L)，置4℃ 2 h。在PBS內(nèi)透析，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗的性質(zhì)測(cè)定

1.7.1 一般特性檢測(cè) 以包被量為0.625 g/L的AFB1-BSA作為包被抗原，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)2種免疫原制備所得的兔血清的靈敏度(采用抑制率質(zhì)量濃度表示，即達(dá)到20%、50%和80%競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)兔血清的質(zhì)量濃度)，選用靈敏度較好的一種兔血清，采用辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化。以羊抗兔 IgG為包被抗原，用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)兔IgG含量。分別以AFB1-BSA、T-2-BSA、OA-BSA、TTX-BSA為包被抗原，以合適質(zhì)量濃度的相應(yīng)單抗-HRP復(fù)合物作為反應(yīng)抗體，以梯度質(zhì)量濃度的兔多抗血清作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，采用直接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)交叉反應(yīng)，鑒定抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗的特異性。

1.7.2 與 AFB1鏡像關(guān)系檢測(cè) ①替代游離AFB1:以包被量為0.625 mg/L的 AFB1-BSA作為包被抗原，以合適質(zhì)量濃度的2G2單抗作為反應(yīng)抗體，不同稀釋度的兔多抗血清和AFB1作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，在相同體系下采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)各自競(jìng)爭(zhēng)2G2單抗上AFB1結(jié)合位點(diǎn)的能力。②替代AFB1包被抗原:分別以經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨兩步沉淀法純化的兔多抗血清(包被量為2.3 mg/L)和AFB1-BSA(包被量為0.625 mg/L)作為包被抗原，不同稀釋度的兔多抗血清和游離AFB1作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，與等體積合適質(zhì)量濃度的2G2-HRP 4℃混合過(guò)夜后，次日100 μL/孔加入酶標(biāo)板，采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)抑制情況。

1.7.3 Ab2β亞型的鑒定 采用小鼠生物學(xué)法。將兔血清用8.5 g/L生理鹽水稀釋成1 g/L，首次用200 μL(即200 μg)兔血清加等體積的CFA充分乳化后免疫BALB/C小鼠，右側(cè)腹腔注射，2周后用0.5 g/L的兔血清 200 μL(即 100 μg)加等體積的IFA充分乳化后加強(qiáng)免疫，而后，每隔2周按第二次免疫法重復(fù)加強(qiáng)免疫。免疫3次后取小鼠內(nèi)眥靜脈血，以0.625 g/L的 AFB1-BSA為包被抗原，檢測(cè)抗體滴度。

2 結(jié)果

2.1 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗的一般特性 F(ab’)2及F(ab’)2-KLH免疫所得的多抗的蛋白含量分別為40和70 g/L，20%、50%和80%競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)的質(zhì)量濃度分別為 1.00、4.00、25.00、7.00、43.75 和 233.33 mg/L。該多抗與抗 T-2 單抗、抗OA單抗和抗TTX單抗交叉反應(yīng)均＜0.1%。

2.2 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗與AFB1的鏡像關(guān)系 制備的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗純化后，替代游離AFB1達(dá)到20%、50%和80%競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)的質(zhì)量濃度分別為1、4和25 mg/L，分別相當(dāng)于0.47、2.74 和16.00 μg/L 游離 AFB1;該抗體替代AFB1包被抗原達(dá)到20%、50%和80%競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)的質(zhì)量濃度分別為1、4和19 mg/L，分別相當(dāng)于0.33、1.35 和5.45 μg/L 游離 AFB1。

2.3 抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗亞型的鑒定 生物學(xué)鑒定小鼠血清稀釋度曲線見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在多抗質(zhì)量濃度達(dá)到2 g/L時(shí)OD(460 nm)值明顯增高，可知所得多抗為Ab2β亞型。

圖1 Ab2β亞型鑒定曲線

3 討論

獨(dú)特型抗體是指具有獨(dú)特型抗原決定簇的抗體，而Ab2是指針對(duì)獨(dú)特型抗體的獨(dú)特型抗原決定簇產(chǎn)生的抗體。根據(jù) Ab2的特點(diǎn)和功能可分為Ab2α、Ab2β、Ab2γ 及 Ab2δ 4 種不同類型，只有Ab2β型是由位于異種抗體(Ab1)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)特型決定簇產(chǎn)生的抗體，根據(jù)抗原抗體在空間構(gòu)象上互補(bǔ)的特點(diǎn)，即獨(dú)特型抗原決定基和抗原的結(jié)合部位相同，Ab2β中存在所謂的抗原內(nèi)影像，可替代抗原用于免疫學(xué)分析[5-6]。

Ab2的制備方法有傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法即多抗或單抗的制備以及基因工程方法[7]。常規(guī)方法是用完整抗體充當(dāng)免疫原進(jìn)行制備，但完整IgG具有以下局限:抗體的Fc段因能與正常細(xì)胞膜上的Fc受體結(jié)合而降低了單抗的特異性;大分子抗體的穿透力不強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)空間位阻大;在異種免疫制備Ab2時(shí)，具有種屬特異性的抗體Fc段免疫原性較強(qiáng)，產(chǎn)生的多是針對(duì)Fc的抗體，而針對(duì)具有抗原特異性的Fab的抗體較少。因此，制備去除抗體Fc段而保留有抗原結(jié)合能力的F(ab’)2或Fab片段，具有重要的意義。以Ab1免疫動(dòng)物獲得血清多抗時(shí)，產(chǎn)物中除了Ab2外還含有抗同種型和抗同種異型決定簇的抗體，而且由于同種型決定簇的免疫原性比獨(dú)持型要強(qiáng)，因而產(chǎn)生的Ab2也主要為抗同種型抗體和抗同種異型抗體[8-10]。為了最大程度地得到Ab2，作者采用了基本剔除了抗同種型和抗同種異型決定簇的Ab1 F(ab’)2片段作為免疫原制備Ab2，得到了靈敏度和特異性較好的Ab2多抗[11]。但在研究中發(fā)現(xiàn)，采用戊二醛一步法連接大分子蛋白KLH的F(ab’)2片段免疫所得的Ab2雖然具有較高的抗體滴度，但是靈敏度較差，原因可能在于采用戊二醛一步法連接時(shí)KLH掩蓋了Ab1 F(ab’)2的抗原決定簇部位，雖然大分子免疫原能產(chǎn)生很高滴度的抗體，但抗獨(dú)特型抗體所占的比例很少，大部分是針對(duì)KLH和F(ab’)2恒定區(qū)的抗體。因此，如要提高抗體免疫原性還需探索。

作者采用經(jīng)典的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)制備的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗，發(fā)現(xiàn)可替代線性范圍為0.03 ～10.00 μg/L 的游離 AFB1。而當(dāng)將該抗體作為包被抗原時(shí)，開始采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陰性空白值始終偏高，檢測(cè)系統(tǒng)可信度不高，原因可能為包被抗原是多抗，酶標(biāo)的羊抗兔二抗也是多抗，交叉反應(yīng)較為嚴(yán)重。作者將單抗聯(lián)結(jié)HRP，采用直接競(jìng)爭(zhēng)一步法進(jìn)行檢測(cè)，以避免交叉反應(yīng)的發(fā)生，以抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗作為包被抗原，可替代線性范圍為 0.02 ～10.00 μg/L 的游離AFB1。經(jīng)過(guò)小鼠生物學(xué)鑒定，ELISA檢測(cè)可知獲得的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多克隆抗體可產(chǎn)生滴度較高的Ab3抗體，證實(shí)為Ab2β型。

該研究通過(guò)抗總黃曲霉毒素單抗F(ab’)2片段免疫日本大耳白兔制備出的模擬AFB1內(nèi)影像的抗抗總黃曲霉毒素單抗獨(dú)特型多抗，可作為AFB1的替代物，為進(jìn)一步研究和開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的無(wú)毒檢測(cè)試劑盒積累了重要資料。

[1]龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2000:26

[2]Hirai M，Mizuno M，Morisue Y，et al.Development of syngeneic monoclonal anti-idiotype antibodies to mouse monoclonal anti-asialoglycoprotein receptor antibody[J].Acta Med Okayuma，2002，56(3):135

[3]夏永娟，黃威權(quán)，黃寶成，等.抗鰻弧菌獨(dú)特型單克隆抗體的制備及鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2001，41(4):447

[4]沈關(guān)心，周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998:32

[5]賀江，樊明濤，梁穎，等.抗獨(dú)特型抗體在小分子物質(zhì)免疫檢測(cè)中的應(yīng)用[J].分析化學(xué)，2010，38(9):1366

[6]劉媛，梁穎，王耘，等.抗獨(dú)特型抗體在小分子農(nóng)藥、真菌毒素免疫檢測(cè)中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(3):398

[7]秦紅，金曉航，黃威權(quán)，等.遲緩愛(ài)德華菌抗獨(dú)特型單鏈抗體基因的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，30(6):689

[8]Mayorga C，Torres MJ，Romano A，et al.Monoclonal antibodies to amoxicillin express different idiotypes determined by anti-idiotype antibodies production[J].Allergy，2002，57(Suppl 72):45

[9]鐘旗，何倩倪，瑪依拉，等.雞傳染性法氏囊病模擬抗原苗免疫作用的探討[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24(4):295

[10]Alvarado-Flores E，Avalos-Diaz E，Diaz LA，et al.Anti-idiotype antibodies neutralize in vivo the blistering effect of Pemphigus foliaceus IgG[J].Scand J Immunol，2001，53(3):254

[11]柳楨，計(jì)融，江濤，等.抗總黃曲霉毒素單克隆抗體2G2 F(ab’)2片段的特性[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，42(1):26