槲皮素鍺對多種腫瘤細胞增殖的抑制作用*

侯鈺佩，郭阿麗，翟廣玉#，馬 巖，馬海英，王 鵬，朱 瑋，渠文濤

1)鄭州大學護理學院 鄭州 450052

2)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450007

3)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

人體內的自由基與多種疾病的發(fā)生有關[1]。槲皮素是天然的自由基清除劑[2]，具有止咳、平喘、抗炎、抗病毒和抗癌等作用[3]。中藥配位化學認為，中藥的有效成分不單純是有機分子，也不單純是微量元素，而主要是有機分子與微量元素組成的配合物。已有研究[4-7]顯示槲皮素可與多種金屬離子螯合形成穩(wěn)定的配合物，并可引起腫瘤細胞生長受抑或凋亡。該研究中作者合成了槲皮素鍺，并觀察了其對多種腫瘤細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑:槲皮素(自制)，氧化鍺(試劑)，RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，青霉素、鏈霉素(HyClone，SH40003-12)，胎牛血清(無噬菌體，低內毒素，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma公司);其他試劑均為分析純。細胞株:人子宮頸癌細胞Hela、人肺腺癌細胞SPC-A-1、人食管癌細胞EC9706與人前列腺癌細胞PC-3購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。儀器:FTS-3000型紅外光譜儀，Perkin-400CHN型元素分析儀，德國耐馳STA 409 PC/PG差熱分析儀，UV-240型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，CJ-2F超凈工作臺(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SIM公司)，倒置顯微鏡(德國萊卡公司)，Spectra Mr型全波長酶標儀(美國Dynex公司)。

1.2 槲皮素鍺的制備 根據文獻[7]的方法適當改進。取1 mmol槲皮素，1 mmol氧化鍺，加入50 mL甲醇，甲醇鈉調節(jié)pH為8.5，于裝有磁力攪拌器和冷凝管的三口燒瓶中，加熱回流6 h。用硅膠G板監(jiān)控反應進程，待反應完成時，停止回流。反應液裝入聚酰胺層析柱，先用水沖洗，再用不同濃度的甲醇溶液梯度洗脫，收集設定區(qū)間洗脫液，旋轉蒸發(fā)儀蒸干有機溶劑得橘黃色固體，用甲醇重提，得深橘黃色固體。所得固體經元素分析，紫外、紅外光譜分析及熱分析鑒定為目標產物后，用滅菌水配制成10 mmol/L的原藥貯存液，4℃保存，臨用時以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3 槲皮素鍺對 Hela細胞、SPC-A-1細胞、EC9706細胞和PC-3細胞增殖的影響 分別取處于對數生長期的上述細胞，調整細胞密度為每孔6×103個，接種于96孔板中，體積分數5%CO2、37℃、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，實驗組加入RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的槲皮素鍺至終濃度分別為10、100 μmol/L，溶劑對照組加入完全培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL，每組設6個復孔。培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察并照相。分別加入5 g/L MTT，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后加入DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，使結晶充分溶解后，采用酶標儀檢測波長570 nm處各孔光密度值。細胞增殖抑制率(IR)=1－(藥物組光密度值/對照組光密度值)×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0處理數據，應用兩獨立樣本t檢驗比較不同濃度槲皮素鍺對4種細胞IR的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

隨著槲皮素鍺濃度的增加，細胞體積急劇變小、變形，貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落，細胞膜完整但出現發(fā)泡現象，細胞核質濃縮或呈碎塊狀。以SPCA-1和EC9706細胞最為典型，見圖1。不同濃度槲皮素鍺對4種腫瘤細胞的IR見表1。

圖1 不同濃度槲皮素鍺處理后SPC-A-1細胞(A)和EC9706細胞(B)形態(tài)的變化(×200)

表1 不同濃度的槲皮素鍺對4種腫瘤細胞的IR(n=6) %

3 討論

槲皮素可與許多金屬離子螯合形成穩(wěn)定的配合物[4]。Tan等[5]發(fā)現槲皮素鋅和槲皮素鎳能夠嵌入DNA的堿基對中，使細胞核皺縮，引起細胞凋亡。Zhou等[6]發(fā)現槲皮素銅與DNA有相互鍵合作用，可抑制癌細胞的惡性生長。Ferrer等[7]發(fā)現槲皮素釩具有抗骨腫瘤的作用。鍺是一種具有多種生物活性的微量元素。有機鍺具有調節(jié)人體免疫和造血機能、清除自由基及抗癌等功效[8]。該研究結果顯示，槲皮素和鍺在堿性條件下，可以生成槲皮素鍺配合物，并通過元素分析，紫外、紅外光譜分析及熱分析鑒定為目標產物。MTT實驗證明，合成的槲皮素鍺體外對Hela細胞、SPC-A-1細胞、EC9706細胞和PC-3細胞的增殖均有抑制作用，以高濃度組作用更為明顯，提示槲皮素鍺具備廣泛的抗腫瘤作用，具有開發(fā)研制為抗腫瘤藥物的可能，其抗腫瘤機制值得進一步研究。

[1]Boots AW，Haenen GR，Bast A.Health effects of quercetin:from antioxidant to nutraceutical[J].Eur J Pharmacol，2008，585(2/3):325

[2]Sultana B，Anwar F.Flavones(kaempeferol，quercetin，myricetin)contents of selected fruits，vegetables and medicinal plants[J].Food Chem，2008，108:879

[3]Russo M，Spagnuolo C，Tedesco I，et al.The flavonoid quer-cetin in disease prevention and therapy:facts and fancies[J].Biochem Pharmacol，2012，83(1):6

[4]Moskaug JΦ，Carlsen H，Myhrstad M，et al.Molecular imaging of the biological effects of quercetin and quercetin-rich foods[J].Mech Ageing Dev，2004，125(4):315

[5]Tan J，Zhu LC，Wang BC.From GC-rich DNA binding to the repression of survivin gene for quercetin nickel(Ⅱ)complex:implications for cancer therapy[J].Biometals，2010，23(6):1075

[6]Zhou J，Wang LF，Wang JY，et al.Antioxidative and antitumour activities of solid quercetin metal(Ⅱ)complexes[J].Transit Met Chem，2001，26:57

[7]Ferrer EG，Salinas MV，Correa MJ，et al.Synthesis，characterization，antitumoral and osteogenic activities of quercetin vanadyl(Ⅳ)complexes[J].J Biol Inorg Chem，2006，11(6):791

[8]Torralvo FA，Pereira CF.Recovery of germanium from real fly ash leachates by ion-exchange extraction[J].Miner Eng，2011，24(1):35