褪黑素對(duì)脊髓損傷早期大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

徐玉生，馬玉斐，李星晨，曾冠楠

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

脊髓原發(fā)機(jī)械損傷后會(huì)引起一系列級(jí)聯(lián)式的病理變化，主要包括局部微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激[1]、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[2]、細(xì)胞壞死和凋亡[3]等，而脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)往往又是全身多發(fā)創(chuàng)傷的一部分，患者病情常常復(fù)雜而嚴(yán)重。目前治療SCI療效確切的藥物并不多，其中最常用的是甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone，MP)，但應(yīng)用 NASCIS 24 h給藥方案可引起繼發(fā)于MP的急性內(nèi)固醇性肌病[4]，大劑量MP還可能引發(fā)肺部及胃腸道并發(fā)癥，易導(dǎo)致高齡者呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥及感染[5]。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體產(chǎn)生的一種作用廣泛且功能強(qiáng)大的吲哚類激素，具備抗腫瘤、調(diào)節(jié)生物體晝夜節(jié)律、抗氧化及清除自由基、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)[6-7]等作用，對(duì)SCI有較強(qiáng)的治療作用，但對(duì)其機(jī)制的研究大多局限于抗氧化及清除自由基方面。作者通過(guò)觀察MT對(duì)SCI大鼠血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)水平、脊髓組織內(nèi)NGF mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，探討MT治療SCI的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(350±30)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(豫)2010-0002。②主要試劑及儀器:Trizol試劑、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、EasyTaq DNA Polymerase試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;大鼠NGF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司;兔抗鼠NGF抗體、DAB試劑盒、SP9002免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;MDA測(cè)定試劑盒、總SOD測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司;MT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國(guó)Applied Biosystems公司);D-140圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific公司)。

1.2 動(dòng)物模型的建立 大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，取后正中切口，以T12為中心顯露T11～T13棘突和椎板，咬除該節(jié)段椎板，暴露脊髓硬膜。先于硬膜上方放置一塊矩形的塑料墊片(0.4 mm×0.3 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用5 g的重錘自距硬膜10 cm的高處沿導(dǎo)管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的標(biāo)準(zhǔn):打擊后鼠尾出現(xiàn)無(wú)規(guī)則的痙攣性擺動(dòng)、雙下肢呈回縮性撲動(dòng)，硬膜表面充血水腫。術(shù)畢以生理鹽水沖洗術(shù)野，再次消毒后常規(guī)縫合。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，每組20只。模型組和MT組按上述方法造模后10 min分別腹腔注射等體積的無(wú)水乙醇及MT(100 mg/kg)，假手術(shù)組僅行椎板切除術(shù)不損傷脊髓。3組大鼠均給予青霉素40萬(wàn)U肌內(nèi)注射，并于術(shù)后4、8 h人工輔助排尿2次。觀察并記錄3組大鼠的一般情況。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 Basso Beattie Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分術(shù)后12 h將大鼠置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，待其適應(yīng)環(huán)境后由2位熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但不知分組者獨(dú)立觀察10 min，進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，取平均值作為評(píng)分結(jié)果。

1.4.2 脊髓組織中NGF mRNA的檢測(cè) BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定完成后，每組大鼠均取12只，斷頭取血，并以損傷處為中心取約1 cm長(zhǎng)的脊髓，生理鹽水沖洗干凈后－80℃條件下保存。取凍存的脊髓標(biāo)本100 mg，研碎后以Trizol法提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄得 cDNA，取2 μL按試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NGF引物序列:正義鏈為 5’-AATCAACTCCTGCTTGGC-3’，反義鏈為5’-GTATTTAGCCCCTCCTCC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度 349 bp。GAPDH引物序列:正義鏈為 5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，反義鏈為 5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度595 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以NGF與GAPDH條帶灰度值的比值表示NGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 血清NGF水平檢測(cè) 血液室溫靜置30 min自然凝固，3000 r/min離心20 min后收集血清，－20℃條件下保存。采用ELISA法檢測(cè)NGF，按試劑盒說(shuō)明操作，最終于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NGF水平。

1.4.4 脊髓標(biāo)本病理觀察和NGF蛋白檢測(cè) 另8只大鼠剖胸后經(jīng)左心室-主動(dòng)脈插管，多聚甲醛灌流固定，以損傷處為中心取出約1 cm長(zhǎng)的脊髓，常規(guī)制片，5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，觀察脊髓病理改變。每只大鼠取同序數(shù)切片3張，按SP9002試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行NGF蛋白檢測(cè)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。胞核和(或)胞質(zhì)黃褐色或黑色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片計(jì)數(shù)高表達(dá)區(qū)3個(gè)高倍視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取算術(shù)平均數(shù)代表該標(biāo)本NGF蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，3組BBB評(píng)分、血清NGF水平、脊髓組織中NGF mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠術(shù)后一般情況觀察 模型組大鼠術(shù)后精神萎靡，進(jìn)食量較術(shù)前明顯減少，飲水增多。MT組和假手術(shù)組大鼠術(shù)后精神狀況明顯好于模型組，進(jìn)食量較術(shù)前無(wú)明顯變化，但飲水均增多。模型組和MT組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的尿潴留情況，均需人工輔助排尿;均出現(xiàn)明顯的后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)為雙側(cè)后肢無(wú)法支撐身體，尾巴持續(xù)下垂或翹起無(wú)力，活動(dòng)時(shí)前后肢動(dòng)作不協(xié)調(diào)，總是由前肢拖動(dòng)身體移動(dòng)等。假手術(shù)組基本無(wú)運(yùn)動(dòng)功能障礙。3組BBB評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與假手術(shù)組比較，模型組和MT組的BBB評(píng)分明顯降低，但模型組與MT組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 3組大鼠脊髓標(biāo)本病理表現(xiàn) 模型組和MT組均可見(jiàn)脊髓組織內(nèi)片狀出血、結(jié)構(gòu)紊亂及神經(jīng)細(xì)胞水腫等變化，但MT組上述病理變化較模型組輕;假手術(shù)組脊髓結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)出血、神經(jīng)細(xì)胞水腫等，見(jiàn)圖1。

2.3 3組大鼠血清NGF水平及脊髓組織中NGF mRNA和蛋白檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2、3和表1。NGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于脊髓前角和其周圍的灰質(zhì)中，多聚集成團(tuán)。由表1可知，與假手術(shù)組比較，模型組和MT組血清NGF水平、脊髓組織NGF蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高，MT組較模型組升高更明顯。

圖2 3組大鼠脊髓組織中NGF mRNA的表達(dá)

圖3 3組大鼠脊髓前角組織中NGF蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 3組BBB評(píng)分、血清NGF水平及脊髓組織NGF mRNA和蛋白的表達(dá)

3 討論

雖然大量的研究已經(jīng)證實(shí)MT對(duì)于SCI具有較強(qiáng)的治療作用，但大多是圍繞其抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3，6-8]等機(jī)制去解釋的，而該研究則主要關(guān)注其對(duì)SCI大鼠體內(nèi)NGF表達(dá)水平是否有影響。NGF是1951年發(fā)現(xiàn)的首個(gè)典型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它對(duì)多種神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、存活和功能的維持具有重要作用。SCI后大鼠體內(nèi)NGF的表達(dá)會(huì)保護(hù)性升高，這種生理反應(yīng)有利于支持受損神經(jīng)細(xì)胞的存活和修復(fù)[9]。但 SCI后局部微環(huán)境中NGF水平不能維持持續(xù)有效是預(yù)后不佳的重要原因之一[10-11]。NGF屬于多肽蛋白質(zhì)，難以透過(guò)血腦屏障，且其生物半衰期短，需長(zhǎng)期反復(fù)給藥才能維持有效的濃度，使得其臨床應(yīng)用受到了很大限制[12]。

作者觀察到SCI模型組和MT組大鼠體內(nèi)NGF水平較假手術(shù)組升高，而MT組大鼠體內(nèi)NGF水平較模型組升高更明顯，且其脊髓的病理變化較模型組減輕，提示MT可以通過(guò)提高體內(nèi)NGF的表達(dá)，促進(jìn)SCI的修復(fù)。MT憑借其高度脂溶性的分子結(jié)構(gòu)，可輕易地穿過(guò)血腦屏障并于數(shù)分鐘內(nèi)在神經(jīng)組織中濃集[13]，同時(shí)具有較高的安全性，在生理和治療劑量下均無(wú)明顯的副作用[14]，使得MT治療SCI更具優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)中MT雖可顯著改善損傷后脊髓的病理變化，但并未改善損傷后早期(12 h內(nèi))大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙，可能是由于該治療劑量的MT還不具備此效力，或是此時(shí)還處于脊髓休克早期，其治療作用還未完全表現(xiàn)出來(lái)。作者將進(jìn)一步觀察應(yīng)用MT后更長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)大鼠體內(nèi)NGF水平的變化規(guī)律及神經(jīng)功能恢復(fù)情況，對(duì)MT治療SCI的機(jī)制進(jìn)行深入探討。

作者還觀察到MT組大鼠術(shù)后在精神狀態(tài)和食欲方面明顯好于模型組。MT可維持生物正常的晝夜節(jié)律，減少由SCI引起的節(jié)律紊亂而造成的疲勞、焦慮和抑郁[15];同時(shí)MT有明顯的鎮(zhèn)痛作用[16]。這些作用也有利于損傷的恢復(fù)。

總之，作者認(rèn)為，MT可通過(guò)抗氧化、調(diào)節(jié)NGF的表達(dá)及改善節(jié)律紊亂等，在SCI治療方面發(fā)揮有效作用，這為臨床應(yīng)用MT治療SCI提供了理論依據(jù)。

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