外源性鋅離子對(duì)大鼠肺組織中表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)及活化的影響*

李 冰，梁 寧，賈陳志，燕 貞，王 威，吳逸明，吳衛(wèi)東

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

二氧化硫是造成大氣污染和影響人體健康的主要因素，其進(jìn)入大氣層后溶于水形成亞硫酸，部分被氧化為硫酸?？諝馕⒓?xì)顆粒物的呼吸道毒性作用與其化學(xué)成分，尤其是某些可溶性金屬離子成分有關(guān)[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)鋅離子是 PM2.5 顆粒物造成呼吸道反應(yīng)的主要因素。研究[4]顯示含鋅化合物可提高人支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞白介素8(interleukin-8，IL-8)的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5-7]結(jié)果顯示，呼吸道灌注可溶性鋅可誘發(fā)大鼠以中性粒細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子含量升高及蛋白滲出為主的呼吸道炎癥反應(yīng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[8-9]表明，鋅離子可激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)分子，如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等。EGFR是一種多功能糖蛋白，廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上，參與上皮細(xì)胞膜的修復(fù)等生理反應(yīng)，在炎癥和癌變組織中高表達(dá)或異常表達(dá)[10]。作者觀察了氣管灌注鋅離子對(duì)大鼠肺組織EGFR表達(dá)、活化的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器 13周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量100～130 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)scxk(豫)2005-0001。硫酸鋅(天津凱通化學(xué)試劑有限公司)，EGFR抑制劑PD153035(美國(guó)Calbiochem公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)，兔抗鼠EGFR抗體、兔抗鼠EGFR-Y1068抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)RD Biosciences公司)，DAB顯色試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。DYY-8C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、SDS-PAGE垂直電泳儀(北京六一儀器廠)，Gene Genius Bio成像系統(tǒng)(美國(guó)Syngene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 20只大鼠隨機(jī)分為4組(DMSO+PBS組、DMSO+硫酸鋅組、PD153035+PBS組、PD153035+硫酸鋅組)，每組5只。先用乙醚將大鼠麻醉，然后根據(jù)分組情況，采用支氣管灌注法分別預(yù)灌注DMSO或1 μmol/L PD153035溶液，灌注劑量為0.5 mL/kg，約30 min后同法分別灌注 PBS或100 μmol/L硫酸鋅溶液，灌注劑量為1 mL/kg。8 h后，將大鼠頸椎脫臼處死，取大鼠肺組織離心提取蛋白。

1.3 EGFR表達(dá)及活化的檢測(cè) 將提取的蛋白用Bradford法進(jìn)行定量，Western blot檢測(cè)EGFR的表達(dá)及活化量。Y1068是EGFR的主要活化位點(diǎn)，因此以Y1068的磷酸化水平表示EGFR的活化量。用Gel-Pro analyzer軟件對(duì)光密度值進(jìn)行分析，作為EGFR的表達(dá)量及活化量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0處理數(shù)據(jù)，采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討預(yù)灌注PD153035和灌注硫酸鋅對(duì)大鼠肺組織EGFR的表達(dá)水平及活化量的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR的表達(dá)情況 結(jié)果見圖1、表1。

2.2 EGFR的活化情況 結(jié)果見圖2、表2。

圖1 4組大鼠肺組織中EGFR的表達(dá)情況

表1 4組大鼠肺組織中EGFR的表達(dá)水平比較(n=5)

圖2 4組大鼠肺組織中磷酸化EGFR的表達(dá)

表2 4組大鼠肺組織中磷酸化EGFR的表達(dá)比較(n=5)

3 討論

EGFR廣泛分布于上皮組織中。呼吸道上皮細(xì)胞中EGFR存在于細(xì)胞膜基底外側(cè)部，參與呼吸道上皮細(xì)胞膜的修復(fù)等[11]。當(dāng)EGFR被外源性毒物等刺激后，可誘發(fā)EGFR單體聚合為二聚體，活化自身酪氨酸激酶，活化的激酶再催化二聚化的EGFR胞內(nèi)發(fā)生交聯(lián)磷酸化，從而激發(fā)下一級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，精確指導(dǎo)各類型細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)由外源鋅離子所致的炎性過程。該研究結(jié)果顯示，加入硫酸鋅后，EGFR的表達(dá)水平及活化量均升高，提示硫酸鋅可致大鼠炎癥反應(yīng)。EGFR是酪氨酸激酶受體，PD153035是酪氨酸激酶抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制EGFR磷酸化。該研究結(jié)果顯示，硫酸鋅單用可致大鼠肺組織EGFR表達(dá)水平及活化量升高，PD153035可降低大鼠肺組織EGFR的表達(dá)水平及活化量，而2者合用，有交互作用，提示硫酸鋅致EGFR的表達(dá)水平及活化量升高，可能與酪氨酸激酶的磷酸化有關(guān)。

綜上所述，氣管灌注外源性鋅離子可致大鼠肺組織中EGFR的表達(dá)水平與活化量增加，其機(jī)制可能與酪氨酸激酶的磷酸化有關(guān)。

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