小鼠腦動(dòng)脈平滑肌鈣激活鉀通道基本特性和動(dòng)力學(xué)調(diào)控研究＊

劉雪茹，譚曉秋，楊 艷，曾曉榮，唐顯玲△

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.麻醉科；2.醫(yī)學(xué)電生理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

大電 導(dǎo)鈣激活鉀通道 （large conductance Ca2＋－activated K＋channels，BKCa）在血管平滑肌等多種組織中表達(dá)，并且在許多病理和生理過(guò)程中起重要作用，是一些內(nèi)源性和外源性血管活性物質(zhì)發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)［1］。BKCa在血管平滑肌細(xì)胞上分布極為豐富，攜帶約70%～80%的外向電流，BKCa的激活引起膜的超極化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性［2］。近年來(lái)，細(xì)胞內(nèi)局部自發(fā)性的Ca2＋釋放事件日益引起了人們的關(guān)注。平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum，SR）上鈉諾定鈣釋放通道的協(xié)調(diào)開(kāi)放產(chǎn)生的鈣火花引起細(xì)胞內(nèi)局部、瞬時(shí)的Ca2＋濃度升高激活鄰近細(xì)胞膜上的BKCa，使其開(kāi)放概率顯著增加，產(chǎn)生自發(fā)瞬時(shí)外向電流（spontaneous transient outward currents，STOCs）［3］。STOCs可進(jìn)一步引起細(xì)胞膜超極化，抑制經(jīng)L型鈣通道的Ca2＋內(nèi)流，促使平滑肌舒張。本研究通過(guò)應(yīng)用兩性霉素B穿孔的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在前期工作基礎(chǔ)上，研究急性酶分離的小鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOCs的基本特性，并利用單通道膜片鉗技術(shù)進(jìn)行通道動(dòng)力學(xué)調(diào)控研究。

1 材料與方法

1.1 材料 正常小鼠10只，體質(zhì)量18～22g，雌雄不拘，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供。F型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、二硫蘇糖醇（DTT）、二巰基赤蘚醇（DTE）、木瓜蛋白酶、清蛋白、兩性霉素B、IbTX均購(gòu)自Sigma公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。采用微管電極拉制儀（PC－10，Narishige，Japan）進(jìn)行玻璃微管電極的拉制，電極在充灌電極液后尖端阻抗為2～4MΩ，電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器（Axopatch 200B）放大，2kHz低通濾波，經(jīng)12位A／D－D／A轉(zhuǎn)換器（Digidata1322A）轉(zhuǎn)換后在專用軟件系統(tǒng)pClamp（Version 9.0，Axon Instruments，USA）控制下記錄并儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)硬盤內(nèi)，采樣頻率為10kHz，適當(dāng)補(bǔ)償串阻后的入口阻抗小于或等于10MΩ。

1.2 單個(gè)腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離 小鼠斷頭處理，迅速取出大腦置于冰的生理鹽溶液（PSS）中，小心分離出大腦底部動(dòng)脈（包括willis環(huán)及其分支），置于4℃低鈣PSS液（0.1mmol／L CaCl2）中，去除血管周圍組織及筋膜，將血管組織置于盛有酶Ⅰ（0.3mg／mL木瓜蛋白酶和0.2mg／mL DTE）EP管中，36.5℃恒溫水浴箱中消化7.0～7.5min；再加入酶Ⅱ（0.8 mg／mL F型膠原酶，1.0mg／mLⅡ型膠原酶和1.0mg／mL DTT）消化7.0～7.5min，輕輕吹打，得到單個(gè)腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，置于4℃冰箱備用。

1.3 全細(xì)胞電流的記錄 全細(xì)胞電流記錄采用兩性霉素B（200μg／mL）穿孔膜片鉗進(jìn)行。浴液為：NaCl 137mmol／L，KCl 5.9mmol／L，MgCl21.2mmol／L，CaCl21.8mmol／L，glucose 14mmol／L，HEPES 10mmol／L，pH 7.4（NaOH）；電極液為：KCl 128mmol／L，NaCl 12mmol／L，MgCl24mmol／L，HEPES 10mmol／L，EGTA 0.05mmol／L，pH 7.2（KOH），200 μg／mL兩性霉素B。對(duì)于宏觀電流記錄采用階躍刺激方案（保持電位－60mV，從－60～＋60mV，時(shí)程400mV）和斜坡刺激方案（保持電位－60mV，從－80～＋70mV，斜率0.375V／s，時(shí)程400ms），刺激頻率1Hz，采樣頻率10kHz。STOCs記錄采用固定某一電位進(jìn)行記錄，時(shí)程30s。

1.4 單通道電流的記錄 單通道電流記錄主要采用insideout構(gòu) 型 進(jìn) 行 。 電 極 內(nèi) 液 成 分 ：K－Asp 40mmol／L，KCl 100 mmol／L，pH 7.2HEPES－K 10mmol／L，EGTA 2mmol／L；浴液成分：K－Asp 100mmol／L，KCl 40mmol／L，pH 7.4HEPESK 10mmol／L和EGTA 1mmol／L。分別記錄不同電壓和不同游離Ca2＋濃 度（0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）下 B KCa的活性，選取膜電位＋40mV時(shí)的電流作為統(tǒng)計(jì)值，分析BKCa的電壓依賴性、Ca2＋敏感性和通道動(dòng)力學(xué)特征。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 M iniAnalysis program（synaptosofl software，leonia，NJ）分析STOCs（鉗制電位＝－30mV，記錄30s）的幅度和頻率，設(shè)定STOCs的閾值為10pA，其余膜片鉗數(shù)據(jù)采用ClampFit 10.1進(jìn)行分析。采用SPSS 14.0軟件單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物濃度與標(biāo)準(zhǔn)化的總開(kāi)放概率（NPo）關(guān)系用 H ill方程Y＝Xb／（cb＋Xb）（X：胞內(nèi)游離 C a2＋濃度；c：Ca2＋解 離常數(shù)（Kd）；b：希氏常數(shù)（nH）。

2 結(jié) 果

2.1 BKCa全細(xì)胞基本特性 本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)記錄BKCa宏觀電流和STOCs，保持電位為－60mV，接近平滑肌細(xì)胞的靜息電位。結(jié)果顯示，BKCa激活呈明顯電壓依賴性，隨著去極化電壓的增加，BKCa宏觀電流密度明顯地增加（圖1）。進(jìn)一步分析宏觀電流特征可以看出，STOCs隨機(jī)疊加于BKCa宏觀電流之上，呈大噪聲樣（圖1）。而對(duì)于STOCs的記錄則在持續(xù)穩(wěn)定的膜電位下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程采樣分析（－50～0 mV，共6個(gè)電位水平，持續(xù)時(shí)間30s）。多個(gè)膜電位水平均可記錄到STOCs，隨著膜去極化電位的增加，STOCs的頻率和幅度均增加，表現(xiàn)出明顯的電壓依賴性。BKCa宏觀電流和STOCs都能被BKCa的特異性阻斷劑IbTX（200nmol／L）抑制（圖1），表明STOCs電流主要為BKCa所攜帶。

2.2 BKCa單通道基本特性 采用inside－out和outside－out膜片記錄BKCa的單通道特性（圖2）。在inside－out構(gòu)型下，本實(shí)驗(yàn)還采用了內(nèi)面向外單通道膜片鉗技術(shù)對(duì)BKCa進(jìn)行研究。在浴液和電極液呈對(duì)稱性高鉀（140mmol／L）狀態(tài)下，鉗制電位從－40mV去極化到＋40mV，每次記錄時(shí)間為30s，可見(jiàn)隨著鉗制電位的增加，通道開(kāi)放頻率明顯增加。將不同電壓下的通道開(kāi)放概率作圖并經(jīng)過(guò)Boltzmann方程擬合，得到通道的電壓依賴性曲線和半數(shù)最大激活電壓（V1／2）為78.09mV。

通過(guò)改變細(xì)胞膜內(nèi)外 K＋濃度，即［K＋］o∶［K＋］i＝140∶140，［K＋］o∶［K＋］i＝140∶6，［K＋］o∶［K＋］i＝6∶140，分別在以上幾種情況下記錄不同鉗制電位下的電流，然后做I－V曲線，經(jīng)Goldman－Hodgkin－Katz方程擬合，得到反轉(zhuǎn)電位與倫斯特方程EK＝（RT／F）ln［K＋］O／［K＋］i計(jì)算得到的理論值基本一致，在對(duì)稱性高鉀溶液中，BKCa的反轉(zhuǎn)電位為零，結(jié)果表明BKCa具有明顯的K＋選擇性（圖2）。在對(duì)稱性高鉀溶液中，通過(guò)計(jì)算得到單個(gè)BKCa電導(dǎo)值為（205.4±43.6）pS（n＝25），表明BKCa具有大電導(dǎo)特性。

圖1 小鼠腦動(dòng)脈平滑肌BKCa宏觀電流和STOCs基本特性

圖2 小鼠腦動(dòng)脈平滑肌BKCa單通道電流基本特性

圖3 胞內(nèi)Ca2＋對(duì)BKCa動(dòng)力學(xué)的影響

另外，改變?cè)∫篊a2＋濃度，可見(jiàn)通道具有明顯的Ca2＋依賴性，開(kāi)放概率隨著浴液游離Ca2＋濃度的增加而增加，在Ca2＋濃度為0.5μmol時(shí)，通道呈多個(gè)水平同時(shí)開(kāi)放，見(jiàn)圖2。將不同［Ca2＋］free時(shí)通道的標(biāo)準(zhǔn)化開(kāi)放概率進(jìn)行擬合，得到［Ca2＋］free的 量 效 曲 線 和 通 道 Ca2＋解 離 常 數(shù) （Kd）為0.881μmol／L（圖2）。在外面向外式膜片下，BKCa的特異性阻斷劑IbTX（200nmol）能明顯抑制該電流（IbTX作用于通道外口）。

2.3 Ca2＋對(duì)BKCa的動(dòng)力學(xué)調(diào)控 為研究Ca2＋對(duì)通道的動(dòng)力學(xué)調(diào)控，選擇了［Ca2＋］free＝0.1μmol／L和0.5μmol／L進(jìn)行分析。從圖3可以看出，［Ca2＋］free＝0.5μmol／L時(shí)，BKCa的開(kāi)放時(shí)間常數(shù)明顯降低［（2.599 0±0.452 6）vs（1.596 0±0.357 3）ms，P＜0.05，n＝5］，但是通道的關(guān)閉時(shí)間常數(shù)沒(méi)有明顯改變［（1.041 0±0.231 4）vs（0.952 0±0.186 3）ms，P＞0.05，n＝5］（圖3）。進(jìn)一步采用開(kāi)放和關(guān)閉兩個(gè)狀態(tài)分析通道的動(dòng)力學(xué)，［Ca2＋］free由0.1μmol／L 增加到0.5μmol／L時(shí)，通道的開(kāi)放速率明顯增加（由384.72s－1增加到626.71 s－1）然而，通道的關(guān)閉速率沒(méi)有明顯影響，見(jiàn)圖3。表明胞內(nèi)Ca2＋通過(guò)促進(jìn)了BKCa由關(guān)閉向開(kāi)放狀態(tài)的轉(zhuǎn)變而激活BKCa，但是沒(méi)有改變通道從開(kāi)放狀態(tài)向關(guān)閉狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

3 討 論

鉀通道及他們攜帶的K＋電流在血管張力的調(diào)節(jié)中十分重要。血管平滑肌上的鉀通道主要有鈣激活鉀通道（KCa），ATP敏感鉀通道（KATP），延遲整流鉀通道和電壓依賴性鉀通道。其中主要為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道，攜帶約70%～80%的外向電流，其功能狀態(tài)及變化對(duì)平滑肌的緊張性調(diào)節(jié)起重要作用［4］。本研究旨在研究小鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa基本電生理特性，包括鈣敏感性、電壓依賴性、K＋選擇性、大電導(dǎo)特性、IbTX依賴性等，結(jié)果表明小鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa具有與人腸系膜動(dòng)脈平滑肌、人奧迪括約肌、支氣管平滑肌、豬冠狀動(dòng)脈平滑肌、大鼠主動(dòng)脈平滑肌等組織BKCa類似的電生理學(xué)特性［5－7］。平滑肌細(xì)胞全胞性胞內(nèi)鈣濃度的增加激活肌質(zhì)網(wǎng)上的納諾定受體，引起胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣（Ca2＋－induced Ca2＋release，CICR），產(chǎn)生鈣火花，這種局部Ca2＋濃度升高激活鄰近的BKCa通道產(chǎn)生STOCs，引起細(xì)胞膜的超極化，導(dǎo)致細(xì)胞舒張。STOCs是胞內(nèi)鈣火花事件在膜電流變化上的體現(xiàn)。因此，STOCs是反 應(yīng) BKCa通 道 胞 內(nèi) 鈣 敏 感 性 的 指 標(biāo) 之 一［3，8－9］。STOCs只在細(xì)胞功能活動(dòng)正常時(shí)才能記錄到。通過(guò)STOCs電流的記錄可以看出，通道電流非常容易記錄，細(xì)胞具有較好的活性，利于研究通道功能調(diào)控和血管活性藥物的作用機(jī)制。

通道動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制是通道功能調(diào)控的重要組成部分。隨著研究的深入，探討藥物作用的門控動(dòng)力學(xué)機(jī)制、分析藥物作用的離子通道靶點(diǎn)已成為目前藥物研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，不同藥物對(duì)BKCa的門控動(dòng)力學(xué)機(jī)制可能表現(xiàn)不一，不同的動(dòng)力學(xué)特征表明藥物作用位點(diǎn)的不同。如中藥厚樸則對(duì)BKCa的開(kāi)放和關(guān)閉狀態(tài)均起作用，一方面促進(jìn)了通道由關(guān)閉向開(kāi)放狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，另一方面抑制了通道由開(kāi)放向關(guān)閉狀態(tài)的轉(zhuǎn)變［10］。本研究得出Ca2＋對(duì)通道的門控動(dòng)力學(xué)主要表現(xiàn)為促進(jìn)了通道由關(guān)閉狀態(tài)向開(kāi)放狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，這與在其他標(biāo)本的研究結(jié)果一致。表明小鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌BKCa可以作為通道門控動(dòng)力學(xué)調(diào)控研究的理想標(biāo)本之一。

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