骨橋蛋白抑制FHIT表達促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖存活＊

骨橋蛋白抑制FHIT表達促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖存活＊

王 麗1，劉曉燕1，李 娟1，楊志惠2△
（瀘州醫(yī)學(xué)院:1.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗室；2.病理學(xué)教研室，四川瀘州 646000）

目的構(gòu)建骨橋蛋白（OPN）基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，研究其對SW480細(xì)胞增殖及生存能力的作用機制。方法構(gòu)建重組表達載體pEGFP－N1／OPN，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞。采用RT－PCR及免疫印跡法（Western blotting）分別檢測SW480細(xì)胞OPN基因及蛋白表達量；Cell Counting Kit－8（CCK－8）測定細(xì)胞增殖；軟瓊脂克隆形成實驗觀察細(xì)胞的錨定非依賴性生長能力。Western blotting檢測脆性組氨酸三聯(lián)體基因（FHIT）和蛋白激酶B（PKB／Akt）蛋白在SW480細(xì)胞中的表達。結(jié)果重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染SW480后，OPN基因獲得很好轉(zhuǎn)錄，OPN蛋白表達增高，細(xì)胞增殖率（光吸收值）顯著高于轉(zhuǎn)染陰性組（P＜0.05），細(xì)胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯多于對照組和空載體組（P＜0.05）；FHIT蛋白在實驗組表達降低，Akt蛋白在各組中的表達無顯著性差異。結(jié)論 OPN基因通過抑制FHIT基因表達，促進SW480細(xì)胞增殖、獨立存活能力。

骨橋蛋白質(zhì)；結(jié)腸腫瘤；脆性組氨酸三聯(lián)體基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化、帶負(fù)電荷、親水性的分泌型糖蛋白［1］。OPN蛋白分子結(jié)構(gòu)內(nèi)有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）結(jié)構(gòu)域，其通過RGD序列能與多種整合素受體結(jié)合，促進細(xì)胞趨化、黏附和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胃癌和肺癌等腫瘤組織OPN高表達，并且與腫瘤進展、預(yù)后相關(guān)［2－3］，但具體作用機制不明確，有待進一步研究。本研究擬構(gòu)建OPN基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，探討OPN對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及存活能力的影響及機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，E.coli TG1菌株及pEGFP－N1載體為本實驗室保存。

1.2 試劑 脂質(zhì)體Lipofectamne2000、LA Taq with GC Buffer PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接酶購自Takara公司；DNA片段快速回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購于Qiagen公司；Cell Counting Kit－8（CCK－8）購自上海同仁化學(xué)研究所；OPN 鼠抗人多克隆抗體、脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT）兔抗人多克隆抗體購自美國Bioworld Technology公司；蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）兔抗人多克隆抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰荆沪拢璦ctin兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 方法

1.3.1 重組表達載體pEGFP－N1／OPN的構(gòu)建與鑒定

1.3.1.1 OPN基因的擴增 提取結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116總RNA，按說明書合成cDNA。根據(jù)OPN序列NM＿001040060設(shè)計引物，上游添加XhoⅠ酶切位點，下游添加BamHⅠ酶切位點，引物序列為F:ACC TCG AGG CCA TGA GAA TTG CAG TGA TTT G，R:TAG GAT CCC GAT TGA CCT CAG AAG ATG CAC T，產(chǎn)物長度為863bp。

1.3.1.2 OPN基因的克隆與測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收863bp處DNA帶，與7Z載體連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，篩選白斑，提取質(zhì)粒，菌落PCR鑒定及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

1.3.1.3 重組表達載體pEGFP－N1／OPN的構(gòu)建與鑒定 用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切7Z／OPN，酶切產(chǎn)物與同樣的酶雙酶切的克隆載體pEGFP－N1連接，構(gòu)建重組表達載體pEGFPN1／OPN，轉(zhuǎn)化E.coli TG1。篩選重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子并提取重組質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后，陽性克隆送上海生物工程有限公司進行序列分析。

1.3.2 pEGFP－N1／OPN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株以含10%胎牛血清的L－15培養(yǎng)液，在37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW480株，轉(zhuǎn)染前1天以3×105密度接種對數(shù)期SW480于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)達到90%融合時，隨機分為3組:空白組（用無菌水代替質(zhì)粒），對照組（加空載體pEGFP－N1）和實驗組（pEGFP－N1／OPN）。每孔加入2mL 無血清培養(yǎng)基，分別配制溶液1（240μL無血清培養(yǎng)基及10μL lip 2 000per well，溫育5min）和溶液2（240μL無血清培養(yǎng)基及4 μg質(zhì)粒per well），混合溶液1、2于室溫下放置20min后逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5%CO2中保溫6 h，之后更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)48～72h，熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。RT－PCR檢測SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN表達；免疫印跡法（Western blotting）檢測SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN蛋白表達量。

1.3.3 轉(zhuǎn)染OPN后SW480生物學(xué)功能研究

1.3.3.1 CCK－8測定細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，以5×104密度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后隨機分為空白組，空載體組和實驗組，每組3復(fù)孔，按常規(guī)方式進行轉(zhuǎn)染，更換含有血清的全培養(yǎng)基后分別培養(yǎng)24、48、72h，在各對應(yīng)時間點取出培養(yǎng)板，每孔加入10μL CCK－8，37℃下繼續(xù)孵育2h，酶聯(lián)免疫檢測儀上以450nm為檢測波長，630nm為參考波長測量各孔的吸光度值（A）。

1.3.3.2 軟瓊脂克隆形成實驗 取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞，用含20%胎牛血清的L－15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／L。制備0.7%和1.2%的低熔點瓊脂糖液，等比例分別與2×L－15培養(yǎng)基混合成上層和下層，加1.5mL下層培養(yǎng)基于6孔板凝固后，將約2 000個細(xì)胞與1.5mL上層培養(yǎng)基混合，加到已凝固的底層瓊脂上，形成雙瓊脂層，置于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)10d，倒置顯微鏡下觀察，鏡下（×40）隨機挑選10個視野計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.3.3.3 Western blotting檢測FHIT蛋白和 Akt蛋白 按Western blotting常規(guī)操作對3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞行FHIT、Akt、βactin蛋白檢測，結(jié)果以累積光密度比值（FHIT IOD／β－actin IOD）表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后OPN基因及蛋白表達 轉(zhuǎn)染48h后檢測OPN基因在SW480中的表達，結(jié)果顯示，空白組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有非常微弱的目的條帶，而重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染組可見850bp左右目的條帶，3組細(xì)胞均在263bp處出現(xiàn)GAPDH目的條帶，表明重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染之后外源OPN獲得很好轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染72h后檢測OPN基因在SW480中的表達，檢查結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞經(jīng)pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染后OPN蛋白表達增高，而空白組和空載體組OPN蛋白表達弱，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，見圖1、2。

2.2 細(xì)胞增殖分析 CCK－8法檢測3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增殖活性逐漸增強，轉(zhuǎn)染pEGFP－N1／OPN質(zhì)粒組與對照組和空載體組相比，任何時間段轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖程度均出現(xiàn)明顯增強，表明OPN具有促進SW480細(xì)胞增殖的作用，而對照組和空載體組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 RT－PCR檢測OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后的表達

圖2 Western blotting檢測OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后的表達

2.3 軟瓊脂克隆形成實驗 本實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pEGFP－N1／OPN后，SW480細(xì)胞軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯多于對照組和空載體組，3組細(xì)胞每視野平均克隆個數(shù)分別為:21.00±3.16，14.40±2.30，14.60±1.14，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.74，P＜0.05）。

圖3 Western blotting檢測OPN轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后FHIT和Akt蛋白的表達

2.4 Western blotting檢測FHIT蛋白和Akt蛋白 FHIT IOD／β－actin IOD在空白組、空載體組和實驗組分別為0.156±0.008、0.165±0.008、0.044±0.006，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝248.47，P＝0.000），兩兩比較顯示實驗組與空白組、空載體組均有顯著性差異，空白組和空載體組間變化不明顯（P＝0.186）；Akt蛋白在3組間的表達分別為0.022±0.004、0.024±0.003、0.024±0.002，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.205，P＝0.820），見圖3。

表1 CCK－8法檢測轉(zhuǎn)染對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響±s）

表1 CCK－8法檢測轉(zhuǎn)染對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響±s）

組別A450 24h 48h 72h空白組0.277±0.010 0.335±0.030 0.457±0.051空載體組 0.232±0.023 0.323±0.028 0.424±0.027實驗組 0.358±0.038 0.614±0.055 0.877±0.025 F 17.763 51.512 147.534 P 0.003 0.000 0.000

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與所處的微環(huán)境密切相關(guān)，因此細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。新近發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如OPN等，在促進腫瘤細(xì)胞生長、存活、侵襲和抗凋亡等方面都發(fā)揮著重要的作用。OPN與其受體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的信號通路引起相應(yīng)基因表達的改變，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［4－5］。OPN與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但OPN促進結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制仍不明確，有待進一步研究［6］。

本研究結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP－N1／OPN轉(zhuǎn)染SW480后，OPN基因獲得很好轉(zhuǎn)錄，OPN蛋白表達增高，OPN能促進SW480細(xì)胞增殖，軟瓊脂克隆形成速度增快，數(shù)量明顯增多。為研究其分子機制，Western blotting檢測FHIT蛋白和Akt蛋白在轉(zhuǎn)染OPN后SW480細(xì)胞中的表達。結(jié)果顯示，與空白組和空載體組相比，F(xiàn)HIT蛋白在實驗組中表達顯著降低；而Akt蛋白在各組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一，可通過調(diào)節(jié)包括核因子－κB在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子參與多種生命活動。研究表明，PI3K／Akt途徑的活化參與多種腫瘤的發(fā)生，抑制該通路可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞在面臨生存壓力時，OPN通過與αvβ3整合素結(jié)合，增強Akt Ser473位點的磷酸化作用，激活PI3K／Akt途徑，拮抗生存壓力，提升細(xì)胞存活能力。根據(jù)本實驗結(jié)果，OPN并沒有引起Akt蛋白表達量增加。

FHIT位于人類3號染色體短臂3p14.2。研究表明，F(xiàn)HIT在人類許多腫瘤組織或細(xì)胞系中呈現(xiàn)高頻率異常，在許多腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中，F(xiàn)HIT基因呈現(xiàn)多發(fā)性、廣泛性的純合性或雜合性缺失，為多種腫瘤的候選抑制基因［7－8］。作為腫瘤抑制基因，它的缺失或失活將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和惡性度的升高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，OPN轉(zhuǎn)染組FHIT蛋白表達降低，故推測OPN通過抑制FHIT表達而促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、存活。

本研究構(gòu)建真核表達載體pEGFP－N1／OPN，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞。結(jié)果顯示OPN通過降低FHIT蛋白表達促進人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖存活能力，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

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OPN regulates the FHIT protein expression to promote the proliferation and survival of SW480＊

Wang Li1，Liu Xiaoyan1，Li Juan1，Yang Zhihui2△（
1.Medical Molecular Biology Laboratory；2.Pathology Teaching and Research Section；Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan646000，China）

ObjectiveTo construct an OPN eukaryotic expression vector，and evaluate its effects on proliferation and survival in SW480colon cancer cells in vitro，exploring the possible mechanism.MethodsOPN gene was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP－N1，after sequencing，the vector was then transfected into SW480cells.The OPN gene and protein expression in transfected cells were demonstrated by RT PCR and Western blotting respectively.The impact on proliferation in transfected SW480cells were investigated by CCK－8method，anchorage independent growth was measured using soft agar assay.Western blotting was used to analyzing the protein of fragile histidine triad gene（FHIT）and protein kinase B（PKB／Akt）.ResultsThe levels of OPN gene and protein in colon cancer SW480cells were distinctly increased after transfection with pEGFP－N1／OPN.The OD450 value of OPN transfection group was higher than negative control group showed by CCK－8method（P＜0.05）.They could also significantly increase anchorage independent growth in vitro.FHIT protein was significantly increased in SW480cells transfected with pEGFP－N1／OPN.ConclusionIn SW480colon cancer cells，OPN was involved in promotion proliferation and survival，by regulating the FHIT protein expression.

osteopontin；colonic neoplasms；fragile histidine triad gene

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.003

A

1671－8348（2012）34－3583－03

四川省科技廳科研項目（07JY029－134）；四川省教育廳科研項目（07ZB110）。 △

，Tel:（0830）3160331；E－mail:yzhih73＠126.com。

2012－06－13

2012－09－12）