奶牛白細(xì)胞介素2基因的克隆及序列分析

蓋仁華，平 麗，李廣興

（1.浙江大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，浙江杭州310058；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL－2）是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，研究表明［1］，IL－2是 T細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)所必需的因子，也是TC細(xì)胞成熟因子，它可促進(jìn)已活化的T細(xì)胞增殖、分化、成熟成為效應(yīng)的TD細(xì)胞和TC細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞表面IL－2R的表達(dá)增加；可使B細(xì)胞活化、增殖，產(chǎn)生抗體；還可活化單核／巨噬細(xì)胞，并能夠增強(qiáng)其殺瘤活性。在體內(nèi)，IL－2是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，還可參與抗腫瘤及移植排斥反應(yīng)［2］。

IL－2具有重要的生物學(xué)特性，可用于免疫治療，協(xié)同治療惡性腫瘤［3］及感染性疾病等［4－5］，目前IL－2在法國(guó)已。獲準(zhǔn)用于艾滋病的輔助性治療［6］。本研究通過(guò)RT－PCR方法克隆了奶牛IL－2基因，并對(duì)其序列進(jìn)行了分析，旨在為大量制備和生產(chǎn)高效價(jià)廉的奶牛IL－2，為在體外大量表達(dá)奶牛IL－2并獲得重組蛋白積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 青年黑白花奶牛，來(lái)源于成高子奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒、工具酶和主要試劑 Trizol抽提試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，p MD18－T載體、DH5α、各種工具酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液為MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的奶牛IL－2基因序列（序列號(hào)：NM＿180997）使用Premier 6.0和 Oligo6.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物：P1：5′－CCCCGAATTCATGTCAGCAATGTACAAGATAC AACTCTTGTCTTGC－3′ ；P2：5′－GGGGCTCGAGT CAAGTCATTGTTGAGTAGATGC－3′。P1含Eco RⅠ酶切位點(diǎn)及起始密碼子，從起始密碼子起36個(gè)堿基均與GenBank上發(fā)表的奶牛IL－2基因序列同源。P2含XhoⅠ酶切點(diǎn)及終止密碼子，引物序列與Gen－Bank上發(fā)表的奶牛IL－2基因序列的475位～498位互補(bǔ)，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為477 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 奶牛外周血淋巴細(xì)胞的分離與活化 根據(jù)于康震［7］的報(bào)導(dǎo)，用淋巴細(xì)胞分離液，從奶牛外周血中無(wú)菌分離淋巴細(xì)胞，用Hank′S液洗2遍。最后將淋巴細(xì)胞重懸于1640完全培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度到107個(gè)／mL。Con A 濃度為7.5 μg／mL加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取 離心收集經(jīng)Con A誘導(dǎo)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，加Trizol并分裝于1.5 mL的EP管中，按Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)提取奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA。提取的奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 奶牛IL－2基因cDNA的合成 以提取的奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，參照寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)合成cDNA。RT反應(yīng)體系為10μL。在反應(yīng)管中分別加入總RNA 模板1μL，10×RT緩沖1μL，MgCl22μL，特異下游引物0.5μL，d NTP混合物1μL，RNA酶抑制劑0.25μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，加滅菌超純水至10μL，置42℃30 min，99℃5 min，4℃5 min，結(jié)束cDNA合成，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 奶牛IL－2基因的克隆及回收 PCR反應(yīng)體系為50μL：在PCR反應(yīng)管中加入cDNA模板10 μL，5×PCR緩沖液10μL，特異上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.25μL，加滅菌超純水至50μL，置PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先94℃預(yù)變性2 min，然后按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。用TaKa－Ra Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0回收PCR產(chǎn)物。取5μL回收產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將純化后的目的片段與p MD18－T載體16℃連接30 min，將連接產(chǎn)物與50μL JM109感受態(tài)細(xì)胞混勻后冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴2 min，再加入890μL的SOC培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)60 min，最后取適量的培養(yǎng)物均勻涂布于含有60μg／mL Amp的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取LB平板上生長(zhǎng)良好的10個(gè)白色菌落，分別接種到含60μg／mL Amp的LB液體培養(yǎng)基上，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，菌落PCR進(jìn)行鑒定。用堿裂解法小量制備重組質(zhì)粒DNA，取少量重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，并用Eco RⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.7 重組奶牛IL－2的序列測(cè)定 鑒定陽(yáng)性的重組菌液，在寶生物工程（大連）有限公司的協(xié)助下，利用ABI PRISMTM377型自動(dòng)測(cè)序儀，進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 純化回收PCR產(chǎn)物鑒定

取純化回收產(chǎn)物5μL，在10 g／L瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果顯示，在500 bp略下方有特異性的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR、雙酶切和PCR鑒定，得到的片段與預(yù)期的片段大小一致（圖2和圖3）。

2.4 序列測(cè)定

測(cè)序結(jié)果顯示，該基因序列有477個(gè)堿基。將所測(cè)得的序列與GenBank序列庫(kù)中的序列號(hào)為NM－180997的奶牛IL－2基因序列進(jìn)行比較后，與其同源性為98.7%，確定擴(kuò)增到的序列是的IL－2基因序列。擴(kuò)增到的序列與參考序列比較發(fā)現(xiàn)，第206位的C突變?yōu)門(mén)和304位的T突變?yōu)镃。其中304位突變?yōu)闊o(wú)意義突變，編碼的氨基酸沒(méi)有變化。第206位的突變導(dǎo)致氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸（圖4）。

2.5 基因序列比較與進(jìn)化樹(shù)的繪制

用DNASTAR軟件，將所得的序列與GenBank中一些動(dòng)物的IL－2序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該序列與奶牛IL－2同源性為98.7%，與水奶牛IL－2同源性為95.3%，與山羊的同源性為在97.4%～97%之間，將該序列與GenBank中7種動(dòng)物IL－2基因序列比較，繪制基因序列進(jìn)化樹(shù)（圖5）。

圖4 序列測(cè)定結(jié)果Fig.4 Sequencing results

圖5 IL－2基因序列進(jìn)化樹(shù)Fig.5 IL－2 gene sequence phylogenetic tree

2.6 氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)

運(yùn)用DNA Star軟件，將奶牛IL－2推導(dǎo)的氨基酸序列與其他動(dòng)物IL－2氨基酸序列比較，根據(jù)不同動(dòng)物IL－2氨基酸序列差異，繪制IL－2氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)（圖6）。由圖可見(jiàn)，IL－2氨基酸進(jìn)化樹(shù)大致可分成兩部分，哺乳動(dòng)物的IL－2大都在第一組，第二組包括小鼠和雞。由進(jìn)化樹(shù)可看出，奶牛IL－2與水牛IL－2、山羊IL－2親源關(guān)系很近。

2.7 各種動(dòng)物IL－2的抗原性比較分析

運(yùn)用DNAStar軟件，比較不同動(dòng)物IL－2的抗原性（圖7）。奶牛IL－2與水牛、山羊的抗原性相當(dāng)接近，特別在N端的10位～60位以及75位～140位氨基酸殘基處圖譜基本一致。而雞IL－2的抗原性與奶牛、水牛及山羊的相差較遠(yuǎn)，尤其在35位～75位及95位～120位氨基酸殘基處，差異顯著。由圖譜可見(jiàn)，所有比較的動(dòng)物中，前20位氨基酸的抗原性相似性均較高，幾乎沒(méi)有抗原性，并且這些氨基酸殘基大部分是疏水性的氨基酸，研究表明，這部分氨基酸殘基構(gòu)成了IL－2的信號(hào)肽。

圖6 IL－2氨基酸進(jìn)化樹(shù)Fig.6 IL－2 amino acid phylogenetic tree

圖7 不同動(dòng)物IL－2抗原性的比較Fig.7 IL－2 antigenicity of different animals

3 討論

從奶牛外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA的質(zhì)量直接影響RT－PCR擴(kuò)增奶牛IL－2基因的數(shù)量。國(guó)內(nèi)尚未有市售的奶牛淋巴細(xì)胞分離液，試驗(yàn)采用人淋巴細(xì)胞分離液對(duì)奶牛外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離。奶牛外周血離心后，霧狀的淋巴細(xì)胞層與紅細(xì)胞層界面不清，分離效果不好。因此，在吸出白細(xì)胞過(guò)程中易吸入較多量的紅細(xì)胞。此時(shí)，用適量的淋巴細(xì)胞分離液再次分離淋巴細(xì)胞，效果較好。

通過(guò)對(duì)多種動(dòng)物的IL－2氨基酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)各種動(dòng)物IL－2中均包含一些十分保守的氨基酸序列。去除信號(hào)肽后，從N端起的7個(gè)氨基酸存在于所有已知的IL－2序列中。該保守序列同樣存在于奶牛IL－2中。對(duì)不同動(dòng)物IL－2序列進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，人IL－2序列中58、105及125位的3個(gè)保守的半胱氨酸，亦存在于其它動(dòng)物中，包括我們擴(kuò)增的奶牛IL－2。奶牛與山羊有5個(gè)氨基酸的差異；奶牛與水牛有5個(gè)氨基酸差異，在這差異的位點(diǎn)上，氨基酸的種類發(fā)生了變化，但酸堿性與疏水性變化不大。由此，我們推測(cè)這三種動(dòng)物的IL－2氨基酸序列差異很小，且空間結(jié)構(gòu)上也十分相似。

IL－2具有種屬特異性。IL－2的空間構(gòu)象決定它能否與IL－2受體（IL－2R）結(jié)合，進(jìn)而決定其種屬特異性。Fassina G等［8］于1995年首次證實(shí)了IL－2Rα的結(jié)合位點(diǎn)位于15～27位氨基酸殘基上，同年，Moreau J W 等［9］證實(shí)了N－端是IL－2Rβ的結(jié)合位點(diǎn)。我們比較了15～27位殘基之間的7種氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，奶牛、水牛及山羊的這部分氨基酸組成完全一致；奶牛與人及猴有兩個(gè)相同位置氨基酸差異，第18位殘基，奶牛是丙氨酸，而人和猴的是蘇氨酸，第20位殘基，奶牛的是甘氨酸，而人和猴的是絲氨酸；奶牛與鼠比較，鼠除了18位是蘇氨酸和20位是絲氨酸外，第15位是蘇氨酸，而奶牛的是丙氨酸。其余的10個(gè)氨基酸殘基在奶牛、水牛、山羊等哺乳動(dòng)物中完全一致。該部分奶牛與雞只有5個(gè)氨基酸殘基相同。不同動(dòng)物IL－2的氨基酸組成有差異，親源性越遠(yuǎn)的動(dòng)物，差異越大。IL－2只有與IL－2R結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)活性。而與IL－2R結(jié)合的IL－2氨基酸序列可以影響生物學(xué)活性的種屬特異性［10］。此外，IL－2的空間構(gòu)型對(duì)于種屬特異性方面也起著重要的決定作用。不同種屬動(dòng)物間，IL－2氨基酸的組成及空間結(jié)構(gòu)上的差異，直接影響它與不同種屬動(dòng)物IL－2R的結(jié)合能力，最終表現(xiàn)為對(duì)不同動(dòng)物生物學(xué)活性上的差別。

［1］Semenzato G.Tumor necrosis factor：a cytokines with multiple biological activities［J］.Br J Cancer，1990，61（3）：354－361.

［2］Li G X，Lillehoj E P，Lillehoj H S.Interleukin－2 production in SC and TK chickens infected with Eimeria tenella［J］.Avian Dis，2002，46（1）：2－9.

［3］李祥瑞，閆慎飛.動(dòng)物細(xì)胞因子的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］，畜牧與獸醫(yī)，1999，31（5）：36－37.

［4］Tang J T，F(xiàn)ang J Y，Gu W Q，et al.T cell immune response is correlated with fibrosis and inflammatory activity in hepatitis B cirrhotics［J］.World J Gastroenterol，2006 ，12（19）：3015－3019.

［5］Dubaniewicz A，Trzonkowski P，Dubaniewicz－Wybieralska M，et al.Mycobacterial heat shock protein－induced blood T lymphocytes subsets and cytokine pattern：Comparison of sar－coidosis with tuberculosis and healthy controls［J］.Respirology，2007，12（3）：346－354.

［6］Alice K P，Jorge A T.Therapeutic use of interleukin－2 in HIV－infected patients［J］.Current Opinion Pharmacol，2002，2（4）：433－439.

［7］于康震，盧景良，谷守林.牛外周血T，B和單核細(xì)胞的分離、鑒定及掃描電鏡觀察［J］，中國(guó)獸醫(yī)科技，1989，12（3）：5－7.

［8］Fassina G，Cassani G，Gnocchi P，et al.Inhibition of interleukin－22／p55 receptor subunit interaction by complementary peptides［J］.Arch Biochem Biophys，1995，318（1）：37－45.

［9］Moreau J W，Bossus M，de Groote D，et al，Characterization of a monoclonal antibody directed against the NH2 terminal area of interleukin－2 and inhibiting specifically the binding of IL－2 to IL－2 receptor beta chain［J］.Mol Immunol，1995，32（14）：1047－1056.

［10］Smith K A.Interleukin－2［J］.Curr Opin Immunol，1992，4（3）：271－276.