IL－18在妊娠早期大鼠下丘腦視前區(qū)核團(tuán)的表達(dá)

杜秋婉，司麗芳＊，顧琨濤，趙 鵬，陳樹林

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

IL－18是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)控型細(xì)胞因子，在抗感染、變態(tài)反應(yīng)性疾病及其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用［1－5］。在生殖以及免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用［6－7］，Guilbert L［8］認(rèn)為，妊娠屬于一種特殊的 Th2現(xiàn)象，外周血液循環(huán)中細(xì)胞因子的比率從Thl型轉(zhuǎn)化為Th2型應(yīng)答，這一現(xiàn)象到妊娠中期達(dá)到高峰，IL－18本身是一種參加機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，在妊娠這種半同種異體移植過程中發(fā)揮著重要作用。IL－18能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞的產(chǎn)生、募集及激活，可以促進(jìn)先天免疫，依賴細(xì)胞因子的微環(huán)境途徑調(diào)節(jié)Th1和Th2型免疫反應(yīng)。研究表明，健康妊娠婦女外周血液中單核細(xì)胞分泌的IL－18／IL－12值與非妊娠婦女相比明顯增高，并且IL－12的分泌減少或IL－18分泌增加均可誘發(fā)Th2型優(yōu)勢，有利于妊娠過程的維持。子宮腔內(nèi)分泌物中IL－18是否存在是預(yù)測胚胎植入成敗的指標(biāo)之一，因此IL－18與妊娠維持有著非常密切的關(guān)系［6］。本試驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)和圖像分析方法，全面研究了大鼠胚泡植入前后期下丘腦視前區(qū)與妊娠調(diào)控有關(guān)的核團(tuán)中IL－18的表達(dá)，以探討IL－18在胚胎植入前后對妊娠調(diào)控發(fā)揮的重要作用，為進(jìn)一步闡明IL－18及其相關(guān)調(diào)控因子在妊娠調(diào)控中的作用及其提高胚胎的植入率提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康性成熟的雌雄SD大鼠，體重200 g左右，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)管理，1周以后用于試驗(yàn)。發(fā)情期鑒定采用陰道涂片方法檢測，取處于發(fā)情期的雄性大鼠與雌性大鼠1∶1合籠過夜。次日清晨逐一檢查合籠雌鼠，發(fā)現(xiàn)雌鼠有陰道栓或精子者即定為妊娠D1。本試驗(yàn)妊娠大鼠隨機(jī)分為2組：植入后期（妊娠D9）妊娠大鼠和 植入前期（妊娠D4）妊娠大鼠，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 取材及其切片 各試驗(yàn)組妊娠大鼠均在上午9時(shí)處死同時(shí)取出下丘腦，隨后迅速置于多聚甲醛磷酸緩沖液（40 mL／L）中后固定12 h～24 h之后，移入4℃、200 g／L蔗糖的PB液中直至組織塊沉底即可。對固定后的下丘腦做連續(xù)的冠狀組織切片，片厚大約35μm，取其中的3套切片。第一套切片用于免疫組化SP法染色；第2套用于Nissl法染色，以用于下丘腦的核團(tuán)定位；第3套組織切片用PBS液代替一抗，用作陰性對照。

1.2.2 主要試劑及其免疫組化操作步驟 一抗采用兔抗鼠的IL－18多克隆抗體（行1∶100稀釋，武漢博士德公司產(chǎn)品），陰性對照組切片采用0.01 mol／L PBS緩沖液體代替一抗，用DAB試劑顯色并貼片，用梯度酒精行脫水，二甲苯透明后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 結(jié)果判斷及其統(tǒng)計(jì)學(xué)處理步驟 呈現(xiàn)藍(lán)色的陽性反應(yīng)顆粒為陽性，細(xì)胞質(zhì)均不顯色呈現(xiàn)陰性表達(dá)。隨機(jī)在切片中選取10個(gè)部位相同但切片不同的高倍鏡視野（400×），用高清晰的圖像分析系統(tǒng)軟件對圖片進(jìn)行分析，計(jì)算所觀察切片的每個(gè)視野中陽性細(xì)胞的陽性強(qiáng)度均值（陽性強(qiáng)度的結(jié)果用平均吸光度表示）及其陽性面積，最后計(jì)算出陽性產(chǎn)物的相對表達(dá)量μ2均值（即μ2＝陽性強(qiáng)度均值×陽性面積×光鏡倍數(shù)／260 000）［9］，其中260 000表示像素。計(jì)量的資料結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差即（ˉX±SD）表示，數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)方法比較各試驗(yàn)組組大鼠下丘腦中IL－18的表達(dá)，P＜0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01為差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL－18在植入后期及植入前期大鼠下丘腦視前室周核的陽性表達(dá)

植入后期妊娠大鼠下丘腦視前室周核中陽性產(chǎn)物呈藍(lán)色或藍(lán)黑色強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性胞體內(nèi)深藍(lán)色的陽性顆粒融合為團(tuán)塊狀，陽性產(chǎn)物染成一片，使得陽性細(xì)胞體的輪廓清晰。在陽性細(xì)胞中，陽性產(chǎn)物均定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。中等陽性表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)呈藍(lán)色的陽性產(chǎn)物均勻分布，陽性反應(yīng)的細(xì)胞多為聚集或分散存在于視前室周核，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)出不規(guī)則的圓形、卵圓形以及梭形等（圖1A）。在植入前期的大鼠下丘腦視前室周核中弱陽性表達(dá)者陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色，陽性表達(dá)細(xì)胞的胞體輪廓模糊不清，在高倍視野下方可看到有少許呈淺藍(lán)色反應(yīng)的陽性顆粒。且陽性細(xì)胞多呈現(xiàn)不規(guī)則的圓形及其卵圓形并且數(shù)量較少（圖1B），陽性表達(dá)量與植入后期相比表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（表1）。

2.2 IL－18在植入后期及植入前期大鼠下丘腦視前內(nèi)側(cè)核的陽性表達(dá)

在植入后期妊娠大鼠下丘腦的視前內(nèi)側(cè)核可見多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性的表達(dá)，陽性產(chǎn)物多定位于胞質(zhì)及胞核。陽性細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或卵圓形，多聚集或分散存在。陽性細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色的陽性顆粒密集，陽性顆粒間相互融合呈藍(lán)黑色的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)（圖1E）。植入前期大鼠的下丘腦視前內(nèi)側(cè)核中陽性產(chǎn)物多為弱陽性表達(dá)且為藍(lán)色，胞體呈圓形或者卵圓形，陽性細(xì)胞體數(shù)量較少并且細(xì)胞體間輪廓不清（圖1F），植入前期陽性表達(dá)的強(qiáng)度與植入后期相比較其差異顯著降低（P＜0.01）（表1）。

圖1 下丘腦視前外側(cè)核及其視前室周核和視前內(nèi)側(cè)核內(nèi)IL－18的陽性表達(dá) （400×）Fig.1 Expression of IL－18 in nucleus pre－opticus medialis and nucleus pre－opticus mango cellularis and nucleus pre－opticus periventricularis of hypothalamus（400×）

表1 IL－18在妊娠大鼠下丘腦內(nèi)的表達(dá)Table1 The expression of IL－18 in hypothalamus of pregnant rats

2.3 IL－18在植入后期及其植入前期大鼠下丘腦視前外側(cè)核的陽性表達(dá)

在植入后期大鼠下丘腦視前外側(cè)核中均可見多數(shù)陽性細(xì)胞相互密集分布，陽性顆粒在陽性細(xì)胞內(nèi)融合成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，陽性產(chǎn)物呈現(xiàn)出藍(lán)黑色或藍(lán)色的強(qiáng)陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞體大多呈現(xiàn)圓形及其卵圓形（圖1C）。植入前期大鼠下丘腦的視前外側(cè)核內(nèi)陽性產(chǎn)物多為弱陽性表達(dá)而且數(shù)量較少。陽性表達(dá)的細(xì)胞多為分散存在，陽性胞體多呈圓形且較?。▓D1D），在下丘腦視前外側(cè)核IL－18的陽性表達(dá)強(qiáng)度與植入后期相比較也顯著降低（P＜0.05）（表1）。

2.4 IL－18在植入前期及植入后期大鼠下丘腦視前區(qū)其他核團(tuán)的表達(dá)

在下丘腦視前區(qū)的其他核團(tuán)如視交叉上核、視上核、視前大細(xì)胞核、弓狀核也有較多的IL－18陽性產(chǎn)物表達(dá)，且陽性表達(dá)量及表達(dá)強(qiáng)度植入后期與植入前期相比，植入后期均高于植入前期（表1）。

3 討論

妊娠的建立、妊娠過程的維持及其分娩啟動(dòng)均與多種細(xì)胞因子調(diào)控密切有關(guān)，其中Th1／Th2型細(xì)胞因子水平能否平衡與妊娠的關(guān)系最為重要，二者在體內(nèi)的平衡狀態(tài)將決定著妊娠的結(jié)局。正常的妊娠狀態(tài)下Th1／Th2型細(xì)胞因子的比例偏向于Th2型漂移，這種漂移將有利于胎兒及其附屬物的生長發(fā)育。分娩發(fā)動(dòng)與體內(nèi)Th1／Th2型細(xì)胞因子的平衡也密切相關(guān)［10－11］。妊娠過程中的母體和胎兒之間存在著及其復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系，流產(chǎn)是免疫排斥的一種表現(xiàn)形式。IL－18本身是一種妊娠調(diào)控因子是Okamura H等［12］于1995年從內(nèi)毒素休克小鼠的肝細(xì)胞中克隆出的分子質(zhì)量為18 ku～19 ku的活性物質(zhì)，近年來多數(shù)的研究均發(fā)現(xiàn)IL－18在生殖調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用，其表達(dá)異常將會(huì)導(dǎo)致生殖系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生。IL－18在Th1／Th2型細(xì)胞因子的平衡調(diào)控中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［13］。Ostojic S等［14］研究表明，IL－12／IL－18參與妊娠機(jī)體子宮中 NK 細(xì)胞的調(diào)控及血管發(fā)育，IL－12／IL－18的基因多態(tài)性將會(huì)變更細(xì)胞因子間的平衡，從而增加妊娠機(jī)體自然流產(chǎn)的發(fā)生率。

IL－18 在免疫細(xì)胞［15］以及內(nèi)分泌細(xì)胞［16］中均有一定的表達(dá)，也是一種在內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間發(fā)揮調(diào)控作用的免疫調(diào)節(jié)因子之一。有報(bào)道表明，下丘腦IL－18的水平如果降低，垂體的內(nèi)分泌功能將會(huì)減弱，最終導(dǎo)致妊娠期間子宮功能發(fā)揮異常，從而對子宮內(nèi)胚胎的存活不利［17］。本研究結(jié)果表明，IL－18在胚泡植入前后期妊娠大鼠下丘腦視前區(qū)的視上核、視前大細(xì)胞核、視前交叉上核、視前室周核、視前內(nèi)側(cè)核、視前外側(cè)核以及弓狀核均廣泛分布，且植入后期的表達(dá)較強(qiáng)于植入前期，表明在胚泡植入的前后期，IL－18通過下丘腦的反饋功能對妊娠調(diào)控發(fā)揮著及其重要的作用，IL－18與妊娠的維持及其妊娠的建立有著密切關(guān)系，IL－18在胚泡植入前、后期對妊娠的調(diào)控功能不僅體現(xiàn)在調(diào)控胚胎的存活方面，在胚胎的生長方面也有一定的調(diào)控作用。在正常有機(jī)體的妊娠過程中IL－18可能還會(huì)與其它細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)，共同維持妊娠這一生理活動(dòng)的正常發(fā)展。

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