致倦庫蚊防御素基因的克隆與原核表達及蛋白純化

王 赟，王吉平，張春林＊，翟素珍

（1.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學生物技術(shù)教研室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學院生物學教研室，貴州貴陽550004）

昆蟲防御素（Defensin）術(shù)語最初用于Sarcophaga peregina和Phormia terranovae的兩個抗革蘭陽性菌抗菌肽，并因與哺乳動物噬菌細胞的一組抗菌肽序列相似而命名為防御素［1］。防御素作為天然免疫的效應分子為生物抵御病原菌的感染提供有效的第一位的防護。其中，昆蟲防御素是昆蟲受到意外傷害或微生物感染時，在血淋巴或消化道中產(chǎn)生的一類抗菌肽。昆蟲防御素通過天然的免疫機制對免疫防御體系不完善的昆蟲起著重要的作用［2］。

蚊蟲在受到外來病原侵襲時，會激活其內(nèi)源的防御素基因的表達，從而起到防御的作用［3］。致倦庫蚊屬于昆蟲綱雙翅目，不僅對人及牲畜騷擾吸血，而且是多種疾病的傳播媒介，如日本腦炎、班氏絲蟲病，其幼蟲孳生于污染的水體，如糞坑、水坑、水溝等，攜帶病原體數(shù)量多，而自身卻并不生病，因而推測其體內(nèi)具有強大的防御系統(tǒng)。

本研究通過RT－PCR技術(shù)獲得了致倦庫蚊防御素基因全長編碼區(qū)，構(gòu)建含有致倦庫蚊防御素成熟肽段的重組表達質(zhì)粒p ET32a－DEF，并優(yōu)化表達菌的培養(yǎng)、誘導條件，以實現(xiàn)重組蛋白的高效表達，最后獲得了純化的重組蛋白，這為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 致倦庫蚊（貴陽株）于2010年采集于貴州貴陽，由貴陽醫(yī)學院生物學教研室飼養(yǎng)繁殖。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 原核表達載體p ET32a（＋）及大腸埃希菌（Escherichia coli）Rosetta、DH5α由貴陽醫(yī)學院生物學教研室保存，克隆載體p MD18－T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和 Hin dⅢ、T4DNA連接酶、PCR TaqTM酶、蛋白質(zhì)Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑Trizol，質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；第一鏈cDNA合成試劑盒為MBI公司產(chǎn)品；IPTG（isopropylthjo－β－D－galactoside，異丙基硫代－β－D－半乳糖苷）、氨芐青霉素、氯霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；His－鎳蛋白純化套裝為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 致倦庫蚊防御素基因的獲取 以岡比亞按蚊防御素氨基酸序列（ABB00947）為探針，對致倦庫蚊EST序列庫進行tBLASTn檢索，得到1條與之同源的序列。將此序列用ORF Finder查找開放閱讀框，并進行Blast比對為潛在防御素編碼基因。

1.2.2 致倦庫蚊防御素基因的擴增、克隆及鑒定根據(jù)比對獲得的致倦庫蚊防御素基因片段設(shè)計引物，上 游 Def F：5′－AGATGAACTCGCTTGGAA－3′，下游 Def R：5′－GGCCAAACAATATTTATTA－3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。采用Trizol法提取致倦庫蚊總RNA，用紫外分光計測定總RNA純度和濃度，cDNA第一鏈的合成按照Fermentas第一鏈合成試劑盒操作說明進行。目的片段擴增條件：94℃5 min；94℃1 min，50℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，并與p MD－18T載體進行連接、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α；藍白斑篩選陽性克隆并經(jīng)菌落PCR驗證后，送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為p MD－DEF。

1.2.3 致倦庫蚊防御素成熟肽基因片段的PCR擴增 根據(jù)測序獲得的防御素基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增成熟肽序列的上下游引物。上游引物CQF為：5′－CGGGATCCTTCCCTCAGGAGTC－3′，下劃線為Bam HⅠ酶切位點；下游引 物CQR為：5′－CCCAAGCTTGTCAGTTTCGGCAGACGC－3′下劃線為Hin dⅢ酶切位點。預計擴增長度為249 bp。以重組質(zhì)粒p MD－DEF為模版，PCR擴增條件：94℃5 min；94℃1 min，60℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 重組表達質(zhì)粒p ET32a－DEF的構(gòu)建及測序分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切p ET32a（＋）質(zhì)粒和防御素成熟肽基因片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將質(zhì)粒與目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行培養(yǎng)，經(jīng)PCR初步篩選陽性克隆，再抽提重組質(zhì)粒用Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切進一步鑒定，最后送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序。測序結(jié)果正確的命名為p ET32a－DEF。

1.2.5 重組表達質(zhì)粒p ET32a－DEF在大腸埃希菌中的表達 分別將空載體p ET32a（＋）和重組質(zhì)粒p ET32a－DEF轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rosetta感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素（100μg／mL）、氯霉素（25μg／mL）的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，次日挑單菌落接種于含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm約為0.6時，加入終濃度為1 mmol／L IPTG誘導4 h后，按常規(guī)進行SDS－PAGE檢測，分析目的蛋白表達情況。

1.2.6 重組菌株誘導條件的優(yōu)化方法 為了獲得大量重組蛋白，以含100μg／mL氨芐青霉素、25μg／mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)和誘導表達的基本條件，對IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度進行了研究。

1.2.6.1 IPTG誘導濃度的優(yōu)化 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600在0.6左右，分別加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol／L 的IPTG，繼續(xù)誘導4 h后取樣，12%SDS－PAGE電泳分析重組蛋白的表達情況。

1.2.6.2 誘導時間的優(yōu)化 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃以180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm在0.6左右，以上一步確定的最佳IPTG濃度進行誘導，分別于誘導后0、1、2、3、4、5、6、7 h取樣，12%SDS－PAGE電泳分析重組蛋白的表達情況。

1.2.6.3 不同誘導溫度下重組蛋白表達形式的檢測 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃以180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600在0.6左右，以前兩步確定的最佳IPTG濃度、最佳誘導時間，分別于20、25、30、37℃進行誘導表達。誘導結(jié)束后，離心收集菌體，菌體沉淀重懸于細菌裂解緩沖液（50 mmol／L Tris－HCl p H 8.0、1 mmol／L EDTA、0.1 mol／L NaCl）中，反復凍融3次，在冰浴中超聲碎菌（200W，超聲3 s，停4 s，重復99次）。12 000 r／min離心30 min，分別取上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳，分析重組蛋白的表達形式。

1.2.7 重組蛋白的純化 根據(jù)優(yōu)化的表達條件，對陽性克隆進行大量的誘導表達。大量誘導表達后的產(chǎn)物經(jīng)4℃、12 000 r／min離心10 min后，用細胞裂解液重懸沉淀，反復3次凍融，并冰浴超聲裂解細菌，收集上清參照His－鎳蛋白純化套裝說明書進行，SDS－PAGE電泳檢測純化的重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 致倦庫蚊防御素基因RT－PCR結(jié)果

致倦庫蚊總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以Def F和Def R為引物擴增，獲得大小約300 bp的特異性擴增條帶，與預期大小相符（圖1）。測序結(jié)果去除兩端引物后獲得長318 bp片段，含有300 bp完整的開放閱讀框，編碼99個氨基酸，將此序列登陸Gen－Bank，登錄號為JQ799049。

2.2 致倦庫蚊防御素成熟肽基因片段PCR擴增結(jié)果

以陽性克隆p MD－DEF為模版，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在250 bp處有一明亮的條帶，與預期擴增長度相符（圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒pET32a－DEF克隆菌的PCR鑒定

用p ET系列載體的通用T7F／R引物和擴增致倦庫蚊防御素成熟肽片段的特異性引物CQF和CQR交叉驗證選取的單菌落是否為陽性克隆，并判斷目的片段插入的方向是否正確。結(jié)果顯示，CQF和T7R擴增產(chǎn)物片段約為350 bp，T7F和CQR擴增片段約為750 bp，與預期結(jié)果一致（圖3），初步證明所挑取菌落為陽性克隆，且目的基因插入載體中的方向正確。

2.4 重組質(zhì)粒p ET32a－DEF的雙酶切鑒定及測序

對空質(zhì)粒p ET32a（＋）和重組質(zhì)粒p ET32a－DEF分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ進行雙酶切，結(jié)果顯示p ET32a－DEF在250 bp出現(xiàn)了一條與PCR產(chǎn)物大小一致的條帶，在約6 000 bp處出現(xiàn)了與p ET32a（＋）雙酶切后大小一致的條帶（圖4），更進一步判斷目的基因成功地與載體連接。測序結(jié)果顯示重組表達質(zhì)粒p ET32a－DEF構(gòu)建成功。

圖4 p ET32a－DEF重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid p ET32a－DEF by enzyme digestion

2.5 重組質(zhì)粒pET32a－DEF在大腸埃希菌中的表達

SDS－PAGE電泳圖可以看出（圖5），誘導后的菌體總蛋白比未誘導的菌體總蛋白在相對分子質(zhì)量約29 ku處可見特異性的蛋白條帶，比空載體誘導后表達的蛋白條帶大，與預期大小相符。

2.6 IPTG濃度對重組蛋白表達的影響

SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖6），IPTG濃度對重組蛋白的表達的影響不明顯，用較低濃度的IPTG（終濃度0.2 mmol／L）即可誘導目的蛋白的大量表達。

2.7 誘導時間對重組蛋白表達的影響

SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖7），以0.2 mmol／L IPTG濃度進行誘導時，在4 h時表達量較高，繼續(xù)延長誘導時間重組蛋白表達量基本維持恒定，因而選用4 h為最終誘導時間。

2.8 誘導溫度對重組蛋白表達的影響

以0.2 mmol／L IPTG濃度分別在20、25、30、37℃誘導表達4 h后，收集菌體經(jīng)超聲破碎及離心分離上清和沉淀，SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖8），重組蛋白在不同溫度均存在于上清中。凝膠灰度掃描顯示，pET32a－DEF重組蛋白在37℃時上清中的表達量最高，占菌體總蛋白的18.3%。

2.9 重組蛋白的純化

以上述確定的最佳表達條件誘導pET32a－DEF重組蛋白大量表達，超聲裂解后將上清按照His– 鎳蛋白純化套裝說明進行純化，SDS－PAGE結(jié)果顯示純化蛋白大小約為29 ku，與目的蛋白大小相符，證明蛋白純化成功（圖9）。

3 討論

昆蟲的免疫系統(tǒng)與高等動物相似，也包括阻止異物侵染的體壁、消化道等物理性屏障，體腔內(nèi)的細胞免疫和多種具有免疫功能的抗菌肽組成的體液免疫［4］。昆蟲防御素屬于富含半胱氨酸的抗菌肽，其主要抗革蘭陽性細菌，偶爾也有抗革蘭陰性細菌或真菌的報道［5］。在抗生素抗藥性日趨嚴重的情況下，昆蟲防御素極可能成為新的抗菌藥物來源。Seufi A M等［6］研究發(fā)現(xiàn)夜蛾防御素對革蘭陽性和革蘭陰性菌均有抑制作用。

致倦庫蚊是多種疾病的傳播媒介，如乙型腦炎、班氏絲蟲病，其幼蟲孳生于污染的水體，如糞坑、水坑、水溝等，攜帶病原體數(shù)量多，而自身卻并不生病，推測其體內(nèi)具有強大的防御系統(tǒng)。Kumar B等［7］就曾利用絲蟲感染和未感染的致倦庫蚊建立差減雜交庫，獲得了7個與致倦庫蚊免疫相關(guān)的基因，其中包括防御素基因的部分序列。因而我們認為防御素是致倦庫蚊免疫系統(tǒng)中的重要成分，體外獲得重組致倦庫蚊防御素蛋白，有利于對其功能和作用機理的研究。

利用基因工程技術(shù)在大腸埃希菌中高水平表達外源基因，從而獲得大量異源蛋白，是現(xiàn)代分子生物學的巨大成就之一［8］。大腸埃希菌作為基因工程表達的首選宿主，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點［9］，能夠解決天然資源匱乏、分離純化困難、化學合成昂貴等問題［10］。

IPTG濃度對外源蛋白在大腸埃希菌中的表達有較大的影響，有時，較低濃度的IPTG即可誘導外源蛋白的大量表達［11］。本試驗結(jié)果顯示IPTG濃度為0.2 mmol／L時即可誘導pET32a－DEF的大量表達，并且增加IPTG的濃度，重組蛋白的表達量沒有提高，所以選用IPTG終濃度為0.2 mmol／L作為誘導該蛋白表達的最佳IPTG濃度。誘導時間也是影響外源蛋白表達的一個重要因素，隨著誘導時間的延長，外源蛋白表達量將會增加，但是到達一定時間后，外源蛋白表達量將趨于恒定，而雜蛋白的表達量會迅速增加［12］。本研究結(jié)果顯示當誘導時間到達4 h后，目的蛋白的表達量較高，隨時間的推移，重組蛋白的表達量不再增加，因而選擇4 h為該蛋白表達的最佳誘導時間。有資料報道，通過低溫可以增加重組蛋白的可溶性表達和表達產(chǎn)物的活性，使包涵體的比例下降［13－14］。本研究分別在20、25、30、37℃對重組蛋白進行誘導表達，經(jīng)超聲破碎后分析蛋白的表達形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白均存在于上清中，以可溶的形式存在，其中在37℃目的蛋白的表達量最高，因而選用37℃為致倦庫蚊防御素蛋白表達的最佳溫度。

綜上所述，本試驗通過RT－PCR技術(shù)擴增獲得致倦庫蚊防御素基因全長編碼序列，成功構(gòu)建了致倦庫蚊防御素重組表達質(zhì)粒pET32a－DEF，并對其在大腸埃希菌Rosetta中的表達條件——IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度進行了優(yōu)化，獲得最佳表達條件為IPTG濃度0.2 mmol／L，誘導時間為4 h，誘導溫度為37℃。在此條件下大量誘導目的蛋白的表達，并經(jīng)His－Ni蛋白純化柱獲得純化的蛋白，為其功能及作用機理的研究奠定了基礎(chǔ)。

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