鮑林對(duì)于血紅蛋白分子學(xué)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)

張宏志 李建

(1玉林師范學(xué)院 廣西玉林 537000；2湖南省邵東縣人民醫(yī)院 湖南邵東 422802)

萊納斯·鮑林(Linus Pauling，1901～1994)被認(rèn)為是“第一位真正的分子生物學(xué)家”，他開拓了眾多生物分子學(xué)新領(lǐng)域，包括抗體的分子機(jī)制、分子醫(yī)學(xué)、分子精神病學(xué)、分子進(jìn)化生物學(xué)等；他還提出了蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)，在DNA結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確測(cè)定10多年以前，就準(zhǔn)確地預(yù)言了其結(jié)構(gòu)特征。加州理工學(xué)院的B. Kamb曾經(jīng)評(píng)價(jià)：“鮑林的知識(shí)、創(chuàng)造力、開拓性沒有哪里比分子生物學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)得更明顯。他被看成是最偉大的化學(xué)家之一，也是第一位真正的分子生物學(xué)家。在這個(gè)領(lǐng)域，他的天才在于他具有認(rèn)識(shí)復(fù)雜生物現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)的能力”[1]。筆者查閱相關(guān)資料，認(rèn)為血紅蛋白研究領(lǐng)域很能體現(xiàn)這位偉大化學(xué)家敏銳的“分子學(xué)”視角和卓越的科學(xué)創(chuàng)造力，所以在此對(duì)鮑林的血紅蛋白分子學(xué)貢獻(xiàn)進(jìn)行介紹。

1 血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)

利用磁性實(shí)驗(yàn)研究血紅蛋白(hemoglobin)的結(jié)構(gòu)特征，是鮑林和科里爾(C.D.Coryell)在20世紀(jì)30年代主要開展的工作；從1935年在ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica上發(fā)表題為《血紅蛋白的氧結(jié)合平衡和結(jié)構(gòu)解釋》的論文起，鮑林在這一領(lǐng)域相繼發(fā)表了20余篇論文。

1.1 血紅素中鐵的成鍵特征

血紅蛋白分子由2條α鏈和2條β鏈組成，每條α鏈和β鏈都包含1個(gè)血紅素。為了弄清血紅素中鐵的成鍵情況，鮑林提出了通過測(cè)量物質(zhì)磁性推測(cè)其結(jié)構(gòu)特征的方法。鮑林和科里爾一起先后成功地測(cè)定了亞鐵血紅素、鐵血紅素、珠蛋白血色素等物質(zhì)的磁性，并且計(jì)算出化合物中金屬中心的未成對(duì)電子數(shù)。

1936年，鮑林和科里爾報(bào)道了血色素及其衍生物的磁性特征和結(jié)構(gòu)。鮑林認(rèn)為，亞鐵血紅素及鐵血紅素的未成對(duì)電子數(shù)分別為4個(gè)和5個(gè)，與Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的未成對(duì)電子數(shù)相同；磁性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與形成4個(gè)dsp2共價(jià)鍵的說法不符，從而證實(shí)了在亞鐵血紅素及鐵血紅素中，F(xiàn)e同相鄰的卟啉N原子之間以離子鍵而不是以共價(jià)鍵的形式存在[2]。

鮑林在同一論文中還根據(jù)珠蛋白血色素、吡啶血色素、煙堿血色素、二腈血色素的未成對(duì)電子數(shù)為0的事實(shí)推測(cè)，在這些物質(zhì)中，F(xiàn)e(Ⅱ)可能是以d2sp3構(gòu)型與其他原子形成共價(jià)鍵，F(xiàn)e(Ⅱ)的2個(gè)3d軌道參與形成共價(jià)鍵；Fe(Ⅱ)同4個(gè)卟啉N原子及2個(gè)其他原子以八面體構(gòu)型結(jié)合[2]。

1.2 氧分子與血紅蛋白的結(jié)合

氧分子與血紅蛋白如何結(jié)合的問題曾長(zhǎng)期懸而未決。當(dāng)時(shí)存在兩種相反的觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為，氧非專一地吸附于血紅蛋白的表面，以范德華力與血紅蛋白結(jié)合；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，氧并不是非專一地吸附于血紅蛋白表面，而是以特定的化學(xué)鍵與血紅蛋白結(jié)合。為了解決這一爭(zhēng)端，鮑林提出通過測(cè)量氧合血紅蛋白的磁性作出判斷，因?yàn)檠醴肿訋в?個(gè)未成對(duì)電子而具有很大的磁矩。假設(shè)氧與血紅蛋白以范德華力結(jié)合，那么未成對(duì)電子數(shù)將不會(huì)改變；而若氧與血紅蛋白以化學(xué)鍵結(jié)合，則未成對(duì)電子數(shù)將發(fā)生變化[1]。鮑林通過測(cè)量發(fā)現(xiàn)，氧合血紅蛋白的未成對(duì)電子數(shù)為0，而氧分子、脫氧血紅蛋白的未成對(duì)電子數(shù)分別為2和16，說明當(dāng)氧分子與血紅蛋白結(jié)合時(shí)，電子結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化[3]；磁性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果否定了氧分子是以范德華力吸附于血紅蛋白表面的觀點(diǎn)。

1.3 一氧化碳血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)

通過測(cè)量一氧化碳血紅蛋白的磁性，鮑林發(fā)現(xiàn)它的未成對(duì)電子數(shù)為0，由此，他推測(cè)一氧化碳血紅蛋白中的Fe(Ⅱ)也可能是以共價(jià)鍵與其他原子結(jié)合，即以d2sp3軌道形成八面體構(gòu)型。在圖1所示Fe(Ⅱ)的6個(gè)d2sp3軌道中，分別有4個(gè)與卟啉N原子、1個(gè)與珠蛋白原子(可能是N原子)、1個(gè)與C原子形成共價(jià)鍵。

根據(jù)1935年L.O.Brockway和P.C.Cross的報(bào)道，鎳羰基化合物中的Ni-C鍵具有雙鍵特征。據(jù)此，鮑林進(jìn)一步提出了一氧化碳血紅蛋白可能的兩種共振結(jié)構(gòu)(圖2)[3]。

圖1 一氧化碳血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

圖2 一氧化碳血紅蛋白的兩種可能結(jié)構(gòu)

同樣，與磁性數(shù)據(jù)相符的氧合血紅蛋白可能的共振結(jié)構(gòu)如圖3所示[3]。

圖3 氧合血紅蛋白的兩種可能結(jié)構(gòu)

1936年，鮑林和科里爾報(bào)道了氧合血紅蛋白和一氧化碳血紅蛋白的磁性特征及其結(jié)構(gòu)。鮑林指出，在結(jié)合氧分子或一氧化碳分子時(shí)，血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化；血紅蛋白與鐵形成的鍵是離子鍵；而氧合血紅蛋白和一氧化碳血紅蛋白分子沒有未成對(duì)電子，血紅蛋白與鐵形成的鍵是共價(jià)鍵，這種鍵型的變化目前只在血紅蛋白的衍生物中被觀察到[3-4]。

在鮑林研究的基礎(chǔ)上，英國化學(xué)家馬克斯·佩魯茲發(fā)現(xiàn)，脫氧血紅蛋白的Fe(Ⅱ)處于高自旋態(tài)，其離子半徑為78pm；而氧合血紅蛋白的Fe(Ⅱ)處于低自旋態(tài)，其離子半徑為61pm。在脫氧血紅蛋白分子中，F(xiàn)e(Ⅱ)處于卟啉環(huán)平面上方約80pm處，當(dāng)Fe(Ⅱ)結(jié)合O2時(shí)，其離子半徑縮小了17pm，使Fe(Ⅱ)從卟啉環(huán)的上方落入環(huán)的平面內(nèi)，從而為氧與血紅蛋白的進(jìn)一步結(jié)合創(chuàng)造了有利的立體化學(xué)條件[5]。

2 鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白與分子病

利用電泳實(shí)驗(yàn)研究鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白是鮑林和哈維·伊泰諾(H.A.Itano)在20世紀(jì)40年代末到50年代主要從事的研究工作之一；從1949年鮑林和伊泰諾在JournalofHematology發(fā)表題為《鐮刀型細(xì)胞貧血癥的快速診斷》的論文起，鮑林等人相繼發(fā)表了15篇有關(guān)的論文。

2.1 鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的電泳速度

鐮刀型細(xì)胞貧血癥(sickle cell anemia)是一種遺傳性疾病，主要在非洲黑色人群中發(fā)生。1910年，美國醫(yī)生J.B.Herrick發(fā)現(xiàn)，鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的紅血球在靜脈循環(huán)和動(dòng)脈循環(huán)中發(fā)生周期性的變化。病人的紅血球在動(dòng)脈血中是正常的圓盤狀，而在靜脈血中卻是異常的鐮刀狀。

人們一般認(rèn)為，鐮刀型細(xì)胞貧血癥僅僅是一種紅細(xì)胞變形而引起的典型細(xì)胞型疾病(a classic disease of cells)；鮑林卻認(rèn)為，鐮刀狀化只發(fā)生在靜脈循環(huán)中而不發(fā)生在動(dòng)脈循環(huán)中，強(qiáng)烈地暗示了鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種血紅蛋白分子的疾??；周期性的變化可能與血紅蛋白在靜脈循環(huán)中以脫氧血紅蛋白形式而在動(dòng)脈循環(huán)中卻以氧合血紅蛋白的形式存在有關(guān)[1]。另外，在O2不出現(xiàn)的情況下，鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的血液用CO飽和后也不會(huì)發(fā)生鐮刀狀化，說明了鐮刀狀化可能與血紅蛋白分子有關(guān)；CO與O2分別能與血紅蛋白結(jié)合成性質(zhì)相似的一氧化碳血紅蛋白或氧合血紅蛋白[1]，從而可防止血紅蛋白細(xì)胞的鐮刀狀化。

根據(jù)上述推測(cè)，鮑林做了3種類型鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白(HbS)和正常血紅蛋白(HbA)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)：① 一氧化碳血紅蛋白溶液；② 亞鐵血紅蛋白溶液(加入連二亞硫酸鈉)；③ 一氧化碳血紅蛋白溶液(加入連二亞硫酸鈉)。其中在第②類實(shí)驗(yàn)中加入連二亞硫酸鈉的目的是防止亞鐵血紅蛋白被氧化為鐵血紅蛋白；第①、③類實(shí)驗(yàn)的差異僅僅在于是否加入連二亞硫酸鈉，目的在于檢驗(yàn)連二亞硫酸鈉本身是否對(duì)電泳有影響[6]。

哈維·伊泰諾是一位醫(yī)學(xué)博士，1945年在圣路易斯大學(xué)獲得博士學(xué)位；1946年9月，經(jīng)導(dǎo)師E. A.Doisy教授推薦來到帕薩迪那跟隨鮑林進(jìn)行鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白研究。鮑林和伊泰諾發(fā)現(xiàn)，鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度比正常血紅蛋白快；在磷酸鹽緩沖溶液中，鐮刀型細(xì)胞一氧化碳血紅蛋白的移動(dòng)速度為2.63×10-5cm/s，而正常一氧化碳血紅蛋白的移動(dòng)速度為2.23×10-5cm/s[6]，即移動(dòng)速度存在0.40×10-5cm/s的差異。鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白與正常血紅蛋白所帶的電荷也是不同的，前者在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)，后者在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，說明鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白和正常血紅蛋白分別帶正電荷和負(fù)電荷。

2.2 鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的等電點(diǎn)

鮑林和伊泰諾進(jìn)一步比較了鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白和正常血紅蛋白的等電點(diǎn)(表1)。

他們發(fā)現(xiàn)，正常人一氧化碳血紅蛋白的酸堿滴定曲線在等電點(diǎn)附近是線性的，等電點(diǎn)1個(gè)pH單位的變化相應(yīng)于血紅蛋白分子13個(gè)電荷變化，這個(gè)結(jié)果與1937年B.German對(duì)馬氧合血紅蛋白實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。

正常脫氧血紅蛋白與鐮刀型細(xì)胞脫氧血紅蛋白等電點(diǎn)的差值為0.23，正常一氧化碳血紅蛋白與鐮刀型細(xì)胞一氧化碳血紅蛋白等電點(diǎn)的差值為0.22，可以計(jì)算出，鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白與正常血紅蛋白之間有3個(gè)電荷的差異；考慮到可能的實(shí)驗(yàn)誤差，鮑林和伊泰諾得出結(jié)論，每個(gè)鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白分子比正常血紅蛋白分子具有額外的2～4個(gè)正電荷[6]。

表1 磷酸緩沖溶液中的等電點(diǎn)(μ=0.1)

2.3 鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的電泳圖譜

鮑林和伊泰諾還比較了4種血紅蛋白溶液的電泳圖譜(圖4)。

圖4 4種不同類型血紅蛋白的電泳圖譜磷酸鹽緩沖溶液中(pH=6.90)：(a) 正常血紅蛋白，單峰；(b) 鐮刀型細(xì)胞貧血癥血紅蛋白，單峰；(c) 鐮刀型細(xì)胞貧血癥攜帶者血紅蛋白，雙峰；(d) 鐮刀型細(xì)胞貧血癥血紅蛋白與正常血紅蛋白各50%，雙峰

鐮刀型細(xì)胞貧血癥攜帶者是正常與鐮刀型細(xì)胞貧血癥的中間階段，癥狀比鐮刀型細(xì)胞貧血癥輕。實(shí)驗(yàn)顯示，鐮刀型細(xì)胞貧血癥攜帶者的血紅蛋白是正常血紅蛋白和鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的混合體，大約各占50%。鮑林推測(cè)，鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的基因是一種純合體(homozygous condition)，有兩條帶病的等位基因；而攜帶者的基因是一種雜合體(heterozygous condition)，只有一條帶病的等位基因[7]。

1949年11月，鮑林和伊泰諾在Science上發(fā)表了題為《鐮刀型細(xì)胞貧血癥——一種分子病》的論文[6]，詳細(xì)報(bào)道了鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白與正常血紅蛋白的差異，并且討論了鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白結(jié)晶的原因、遺傳機(jī)制等問題。

鮑林對(duì)鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的研究第一次展示了這種疾病的分子基礎(chǔ)，第一次提出分子病的概念，吸引了醫(yī)學(xué)科研人員從分子層次上進(jìn)行疾病研究。1956年，英國科學(xué)家V.M.Ingram聯(lián)合使用電泳和紙層析技術(shù)對(duì)鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白的單氨基酸替換現(xiàn)象：正常血紅蛋白β鏈的第6位置是谷氨酸，而鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白β鏈的第6位置卻變成了纈氨酸；谷氨酸帶一個(gè)單位的負(fù)電荷，纈氨酸不帶電荷，這就進(jìn)一步解釋了鮑林和伊泰諾發(fā)現(xiàn)的鐮刀型細(xì)胞血紅蛋白與正常血紅蛋白的帶電荷數(shù)及電泳速度的差異。

3 血紅蛋白氨基酸序列與分子鐘

對(duì)血紅蛋白氨基酸序列與生物進(jìn)化問題的探討是鮑林和埃米爾·朱克坎德爾(E.Zuckerkandl)在20世紀(jì)60年代的主要研究領(lǐng)域。從1959年鮑林在ChemicalandEngineeringNews發(fā)表題為《分子和進(jìn)化》的論文起，鮑林和朱克坎德爾一共發(fā)表了8篇論文。

3.1 指紋圖譜與物種的親緣關(guān)系

聯(lián)合使用電泳和紙層析技術(shù)，鮑林比較了3種類型的指紋圖譜：

① 一個(gè)物種在不同階段的指紋圖譜。例如，成年人與胎兒的指紋圖譜比較。

② 不同物種在一定時(shí)期的指紋圖譜。例如，人與黑猩猩、大猩猩、猩猩和羅猴的指紋圖譜比較；人與牛、馬、豬的指紋圖譜比較；人與硬骨魚、肺魚和鯊魚的指紋圖譜比較。

③ 一個(gè)物種在不同時(shí)期的指紋圖譜[8]。

從①的比較中發(fā)現(xiàn)，成年人的指紋圖譜與人的胎兒的指紋圖譜相差很大，而成年人的指紋圖譜與成年馬的指紋圖譜卻比較相似；鮑林推測(cè)，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性因素可能是造成這種現(xiàn)象的重要原因[8]。從②的比較中發(fā)現(xiàn)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物的指紋圖譜與人的指紋圖譜十分相似，牛和豬的指紋圖譜與人的指紋圖譜相差較大，而魚的指紋圖譜與人的指紋圖譜相差更大；從豬、牛、人指紋圖譜的兩兩相互比較中，鮑林發(fā)現(xiàn)豬、牛與人的變化往往出現(xiàn)在相同的部位；鮑林推測(cè)，可能在血紅蛋白分子中存在著容易突變的區(qū)域，或者這些區(qū)域的突變更易于被自然選擇保存下來[8]。

鮑林還根據(jù)人與靈長(zhǎng)類動(dòng)物指紋圖譜的相似性，對(duì)正常基因和突變基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了推測(cè)。鮑林認(rèn)為：人的血紅蛋白與靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血紅蛋白相比沒有大的變化，反映了血紅蛋白α、β鏈的正?；蚺c突變基因相比具有更大的穩(wěn)定性，突變基因往往會(huì)回復(fù)突變(back-mutation)回到正?；?；除了自然選擇因素之外，基因本身的熱力學(xué)穩(wěn)定性也可能是決定等位基因分布的重要因素[8]。

3.2 分子鐘與物種分歧的時(shí)間

根據(jù)人與馬血紅蛋白氨基酸數(shù)目的差異以及古生物學(xué)證據(jù)，鮑林和朱克坎德爾還推斷出每個(gè)有效突變的時(shí)間。人與馬血紅蛋白的α鏈大約有150個(gè)氨基酸，每條α鏈上具有9個(gè)有效的突變。由于人與馬是在大約1.3×108年前分歧的，據(jù)此可以計(jì)算出每個(gè)有效突變的時(shí)間約為1.45×107年[1]。

1962年，在論文《分子病、進(jìn)化與基因的異質(zhì)性》中，鮑林和朱克坎德爾進(jìn)一步推斷出物種分歧的時(shí)間和相應(yīng)的地質(zhì)時(shí)期[1]。在表2中，δ鏈和γ鏈的氨基酸數(shù)目的差異為36個(gè)，物種分歧的時(shí)間為260百萬年前的石炭紀(jì)前期；α鏈和β鏈的氨基酸數(shù)目差異更大，其祖先序列出現(xiàn)在565百萬年前的石炭紀(jì)末期。

表2 血紅蛋白鏈與物種分歧的時(shí)間

1964年9月17日，由V.Bryson和H.Vogel組織的“進(jìn)化的基因和蛋白質(zhì)”學(xué)術(shù)會(huì)議在美國羅格斯大學(xué)的微生物研究所舉行，朱克坎德爾正式提出了分子鐘的概念。羅格斯會(huì)議被認(rèn)為是現(xiàn)代分子進(jìn)化生物學(xué)的標(biāo)志[7]。在羅格斯會(huì)議之后，人們就分子學(xué)與形態(tài)學(xué)方法的優(yōu)劣、分子的異速進(jìn)化進(jìn)行了熱烈的討論，這些討論促進(jìn)了生物學(xué)家、分子生物學(xué)家、進(jìn)化論者以及遺傳學(xué)家之間的交流。

3.3 已滅絕生物的分子復(fù)原

1963年，鮑林和朱克坎德爾提出了重建滅絕生物氨基酸序列的方法[9]。鮑林指出，如果兩條同源多肽鏈上指定分子部位的氨基酸殘基是一樣的，那么就有一定的把握認(rèn)為這個(gè)氨基酸殘基在它們祖先序列上也同樣存在；如果在3條同源多肽鏈中的兩條鏈上出現(xiàn)同一個(gè)氨基酸殘基，而在另一條鏈上不出現(xiàn)，那么可以推斷，是生物進(jìn)化中的突變導(dǎo)致了這種差異[9]。

分子復(fù)原研究的重要意義在于，可以獲得古代生物功能、生物環(huán)境的信息，獲得高于分子水平的認(rèn)識(shí)。鮑林認(rèn)為，根據(jù)現(xiàn)存物種相關(guān)多肽鏈的古生物化學(xué)研究，可以推測(cè)滅絕生物基因的組成；如果合成這些滅絕生物的組成部分，不僅可以研究它們的物理化學(xué)特性，還可以推測(cè)它們的生物功能。例如，血紅蛋白對(duì)氧的親和性、對(duì)pH的依賴性以及祖先酶對(duì)底物的親和性等。當(dāng)滅絕生物的古基因信息積累得足夠多時(shí)，做出有機(jī)體整體的推斷將變得可能[9]。

鮑林和朱克坎德爾的分子進(jìn)化生物學(xué)研究，開創(chuàng)了探討物種親緣關(guān)系、物種分歧時(shí)間、滅絕生物的新途徑，將“古生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域統(tǒng)一起來了”[10]。G.T.Morgan指出，20世紀(jì)60年代見證了分子進(jìn)化生物學(xué)的誕生，鮑林與朱克坎德爾奠定了這個(gè)新學(xué)科的基礎(chǔ)[7]。

4 結(jié)語

鮑林對(duì)于血紅蛋白分子學(xué)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，開創(chuàng)了分子醫(yī)學(xué)和分子進(jìn)化生物學(xué)的新領(lǐng)域，對(duì)后續(xù)研究產(chǎn)生了重要的影響。以分子鐘為例，幾十年來，科學(xué)家相繼在分子鐘理論、分子鐘應(yīng)用、寬松分子鐘方法等方面取得了重要的進(jìn)展。

1963年，E.Margoliash在研究細(xì)胞色素C時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬和豬、金槍魚、酵母的氨基酸數(shù)目差異分別為3、19、44，顯示了親緣關(guān)系和遺傳距離之間的聯(lián)系[11]；1968年，M.Kimura在Nature上發(fā)表了題為《分子水平上的進(jìn)化速率》的論文，提出遺傳漂移和中性理論，為分子鐘奠定了理論基礎(chǔ)。

20世紀(jì)80年代，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了DNA分子鐘的研究。1980年，T.Miyata對(duì)人、鼠、兔的研究發(fā)現(xiàn)，各種哺乳動(dòng)物DNA的進(jìn)化速率幾乎一樣；1986年，R.J.Britten的研究卻發(fā)現(xiàn)，人與嚙齒動(dòng)物DNA的進(jìn)化速率存在著明顯差異[12]；1993年，DNA進(jìn)化速率與機(jī)體大小的關(guān)系引起了人們的注意，雖然一般認(rèn)為有機(jī)體的大小并不直接影響分子進(jìn)化的速率，但大的有機(jī)體往往具有長(zhǎng)生命周期和慢代謝速率；1994年，D.M.Rand發(fā)現(xiàn)，這些差異可能通過某種方式影響mtDNA的突變率[12]。

在應(yīng)用方面，分子鐘已經(jīng)應(yīng)用于前寒武紀(jì)生物大爆發(fā)、被子植物的起源、人類的起源等許多領(lǐng)域。前寒武紀(jì)是地球生命演化的重要時(shí)期，但前寒武紀(jì)生物大多是軟體類生物，化石記錄貧乏，而分子鐘為前寒武紀(jì)生物研究開辟了新的途徑。1996年，R.F.Doolittle對(duì)57種酶蛋白的531個(gè)氨基酸序列進(jìn)行分析，所得到的系統(tǒng)樹與16rRNA系統(tǒng)樹在分枝的長(zhǎng)度和順序上非常吻合。通過這項(xiàng)研究，R.F.Doolittle認(rèn)為原核生物和真核生物的分支時(shí)間約為20億年，為植物和動(dòng)物分支時(shí)間的兩倍。1996年，G.A.Wray對(duì)后生動(dòng)物門類的分子鐘研究表明，原口動(dòng)物和后口動(dòng)物在12億年前分支，并得出了在前寒武紀(jì)已經(jīng)出現(xiàn)后生動(dòng)物的結(jié)論[13]。

在人類的起源方面，1986年，牛津大學(xué)的科學(xué)家從對(duì)現(xiàn)代8個(gè)種群的700個(gè)個(gè)體的β胡蘿卜素基因的研究得出結(jié)論，人類祖先來源于非洲并不斷向外遷移；1987年，R.L.Cann等對(duì)5個(gè)地理區(qū)域的147個(gè)人的胎盤提取mtDNA的研究表明，所有這些mtDNA主干都來自20萬年前的非洲祖先[14]。

在分子的異速進(jìn)化方面，科學(xué)家也進(jìn)行了多方面探討，發(fā)展出了目前的寬松分子鐘方法，包括相對(duì)速率檢驗(yàn)法、局域分子鐘法、貝葉斯計(jì)算法等。這些探討大大深化了分子鐘研究，取得了許多重要的成果。

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